龔 雪 韓奇亨 任 凱 張國俊 張春紅 李旻輝,2,3,4,5*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；4. 內(nèi)蒙古自治區(qū)特色藥用植物培育與保護(hù)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；5. 內(nèi)蒙古自治區(qū)特色道地藥材資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

黃稔根為野牡丹科酸腳桿屬植物北酸腳桿Medinilla septentrionalis(W.W.Sm.)H. L. Li的干燥全株，瑤藥名為紅節(jié)風(fēng)，黃稔根生于山谷、山坡密林中或林緣陽濕處，分布于廣東、廣西、云南等地。收載于《中華本草》和《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(第一卷)，黃稔根味苦、酸，性平。歸肝、大腸經(jīng)，瑤藥中屬風(fēng)打相兼藥。具有清熱解毒、止血涼血、消腫止痛之功效，用于小兒驚風(fēng)、熱感冒、尿淋、尿血、月經(jīng)不調(diào)、牙齦出血、牙周炎[1-4]?；诖耍狙芯恳灾嗵?Lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7而構(gòu)建的炎癥細(xì)胞模型為研究對象，采用黃稔根不同極性部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)處理炎癥模型，對黃稔根4個(gè)不同極性部位進(jìn)行活性篩選，探討黃稔根不同極性部位對細(xì)胞的安全性及抗炎效果，為黃稔根的抗炎機(jī)制作用研究奠定基礎(chǔ)，為指導(dǎo)臨床安全用藥和擴(kuò)大其開發(fā)利用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 黃稔根采于廣西壯族自治區(qū)上林縣大明山，經(jīng)廣西藥用植物園韋坤華副研究員鑒定為野牡丹科植物北酸腳桿。藥材干燥全株經(jīng)粉碎成中細(xì)粉(過四號篩)，采用乙醇提取法，以70 %乙醇加熱回流提取3次，合并提取液濃縮至干，殘?jiān)铀芙?，分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各自萃取液濃縮至干，即得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4個(gè)極性部位。實(shí)驗(yàn)前用DMSO配成200 mg/mL的母液，再用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，Sigma公司)；DMSO和青霉素、鏈霉素(?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，sigma公司)。

1.1.3 儀器 Thermo 311 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，SW-CJ超凈臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，XDS-1B倒置顯微鏡(上海比目儀器廠)，Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀(Thermo公司)，臺式離心機(jī)(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7用含10 %胎牛血清，100 mg/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 黃稔根不同極性部位對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 RAW264.7細(xì)胞按1×105 個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入系列濃度( 12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黃稔根不同極性部位。同時(shí)設(shè)空白對照(未加黃稔根不同極性部位)，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)，根據(jù)公式：細(xì)胞存活率 = (藥物孔OD值-本底對照孔OD值) /(對照細(xì)胞孔OD值-本底對照孔OD值)×100 %計(jì)算細(xì)胞存活率[6]。

1.2.3 黃稔根不同極性部位對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞按1×105 個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黃稔根不同極性部位，保護(hù)4 h后加入終濃度為1μg/mL的LPS。設(shè)空白對照組、LPS組，LPS組+黃稔根不同極性部位組，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，培養(yǎng)20 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值( OD 570 nm)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果

2.1 黃稔根不同極性部位對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測黃稔根不同極性部位對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，與空白組比較，黃稔根不同極性部位系列濃度(25、50、100、200 μg/mL)對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用無顯著性差異(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)黃稔根的不同極性部位對細(xì)胞增殖無影響，無細(xì)胞毒性作用(圖1)。

2.2 黃稔根不同極性部位對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用 與LPS模型組比較，濃度為50、100、200 μg/mL黃稔根乙酸乙酯部位(圖2-b)和正丁醇部位(圖2-c)能顯著改善LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)，具有較好的濃度依賴性(P< 0.05)，表明乙酸乙酯和正丁醇部位在較高濃度下具有較好的保護(hù)活性。而相同濃度的黃稔根石油醚部位(圖2-a)與LPS模型組相比僅在200 μg/mL濃度下有保護(hù)性作用，而在其它濃度下無保護(hù)性作用(P>0.05)。不同濃度的黃稔根水部位(圖2-d)并未表現(xiàn)出保護(hù)作用，無保護(hù)活性。

3 討論

我國是一個(gè)多民族的國家，自古以來，各少數(shù)民族在與疾病斗爭中，形成了各具特色的傳統(tǒng)醫(yī)藥。黃稔根雖然為瑤醫(yī)常用藥，但對其藥理研究卻甚少。為此，本實(shí)驗(yàn)對黃稔根對細(xì)胞的安全性及其抗炎活性進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示黃稔根不同極性部位對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7無細(xì)胞毒性。通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型分析黃稔根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位的保護(hù)性作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃稔根乙酸乙酯部位和正丁醇部位能顯著改善LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)且呈現(xiàn)出較好的濃度依賴性。上述研究結(jié)果初步證明黃稔根對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，該結(jié)果可為進(jìn)一步闡明其抗炎機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另外，針對黃稔根乙酸乙酯及正丁醇活性部位還需利用現(xiàn)代化學(xué)等技術(shù)手段進(jìn)行進(jìn)一步的分離和分析以確定活性單體化合物。同時(shí)，黃稔根對RAW264.7細(xì)胞炎癥是基于哪些信號通路來發(fā)揮抗炎作用的也需要更深一步的研究。