伍國(guó)強(qiáng)，劉海龍，李智強(qiáng)

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730050）

甜菜（Beta vulgaris L.）屬藜科（Chenopodiaceae）二年生草本植物，是我國(guó)及世界的第二大糖料作物，其糖產(chǎn)量?jī)H次于甘蔗，占世界總產(chǎn)糖量的30%左右[1－2]。甜菜全身是寶，制糖后產(chǎn)生的副產(chǎn)品甜菜粕仍含有糖分，且富含多種無(wú)機(jī)鹽和含氮化合物，適口性好，具有較高的飼用價(jià)值[3]；同時(shí)甜菜粕也是一種生產(chǎn)纖維素的優(yōu)質(zhì)資源，將其轉(zhuǎn)化后進(jìn)行乙醇的規(guī)模化生產(chǎn)，既能夠?qū)崿F(xiàn)資源的充分利用，也有利于甜菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4－5]。

當(dāng)前甜菜育種主要依賴(lài)其種屬間的雜交[6]。在過(guò)去的數(shù)十年間，科研人員通過(guò)雜交育種手段使栽培甜菜的品質(zhì)得到了大幅度提高[7]。然而，由于近年來(lái)甜菜優(yōu)良種質(zhì)資源日趨匱乏，使得傳統(tǒng)育種方法在培育高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的甜菜品種的難度逐漸增大[8]。利用基因工程技術(shù)提高作物品質(zhì)或抗逆性，培育新品種是當(dāng)前作物育種研究的熱點(diǎn)之一。然而，無(wú)論利用農(nóng)桿菌侵染法、基因槍法，還是顯微注射法，都需要以植物的組織培養(yǎng)技術(shù)作為依托[9]。目前，研究人員已經(jīng)以甜菜子葉、下胚軸、葉片和葉柄等作為外植體，通過(guò)直接或間接的器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得了再生植株[10－13]；但植株再生過(guò)程中仍然存在愈傷組織分化率和生根率偏低等困難，導(dǎo)致基因遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的效率極低[14]。此外，已建立的甜菜再生體系中所用甜菜品種基因型復(fù)雜多變，大多體系不能在需要改良的甜菜品種上重復(fù)進(jìn)行。因此，有必要對(duì)當(dāng)?shù)卦耘嗟膬?yōu)良甜菜品種的組培誘導(dǎo)體系進(jìn)行改良和優(yōu)化。

Wu等采用隸屬函數(shù)法建立了甜菜農(nóng)學(xué)和生理學(xué)指標(biāo)耐鹽抗旱性的綜合評(píng)價(jià)體系，并篩選出了適合于我國(guó)北方干旱、半干旱地區(qū)及鹽漬化地區(qū)栽培的品種 “甘糖7號(hào)”[15－16]。該品種是以多粒二倍體雄性不育系MS2007－2A為母本，多粒二倍體授粉系P2007為父本，按3∶1比例配制雜交選育而成的，具有適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[17]。然而，目前還未有人對(duì)“甘糖7號(hào)”的組培體系進(jìn)行系統(tǒng)研究。鑒于此，本研究以“甘糖7號(hào)”甜菜品種的葉柄為材料，對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生條件進(jìn)行研究，以期為糖料作物甜菜抗逆遺傳改良及其基因工程育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子處理及無(wú)菌苗的獲得

挑取甜菜“甘糖7號(hào)”均勻飽滿(mǎn)的種子（由甘肅武威市三農(nóng)種業(yè)科技有限公司提供），加入濃硫酸浸泡2 h后，用自來(lái)水沖洗4～5次后晾干備用。將上述處理后的甜菜種子置于超凈工作臺(tái)中，用75%酒精消毒1～2 min，再用3%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次后接種于MS固體培養(yǎng)基（3%蔗糖、0.8%瓊脂）上使其萌發(fā)，約30 d后獲得甜菜無(wú)菌苗（圖1 A），采集甜菜葉柄用于愈傷組織誘導(dǎo)。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加(1)4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(2)5 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(3)6 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(4)7 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA作為愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每個(gè)培養(yǎng)皿接20～30個(gè)外植體，每種培養(yǎng)基4個(gè)重復(fù)。20 d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，并選擇生長(zhǎng)良好的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代周期為15 d。愈傷組織誘導(dǎo)率=（形成愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.3 愈傷組織的分化

以MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加(1)4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(2)5 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(3)6 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(4)7 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA；(5)4 mg/L 6－BA+1 mg/L NAA；(6)5 mg/L 6－BA+1 mg/L NAA；(7)6 mg/L 6－BA+1 mg/L NAA ；(8)7 mg/L 6－BA+1 mg/L NAA 作為愈傷組織分化的培養(yǎng)基。選取直徑約1 cm生長(zhǎng)良好，且顏色為淡黃色，疏松易碎的愈傷組織接種于上述培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿（組培瓶）轉(zhuǎn)接8個(gè)愈傷組織塊，每種培養(yǎng)基4個(gè)重復(fù)。45 d后觀察，統(tǒng)計(jì)不定芽分化情況；繼代周期為20 d。不定芽分化率=（分化出不定芽愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)）×100%。

1.4 生根培養(yǎng)基的篩選

待愈傷組織分化出的不定芽生長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，將不定芽從愈傷組織上切下分別轉(zhuǎn)接至(1)MS+0.05 mg/L NAA；(2)MS+0.1 mg/L NAA；(3)1/2MS+0.05 mg/L NAA；(4)1/2MS+0.1 mg/L NAA進(jìn)行生根培養(yǎng)。45 d后觀察生根情況；繼代周期為20 d。生根率=（生根的芽數(shù)/接種的芽數(shù)）×100%。

1.5 煉苗移栽

將根系發(fā)達(dá)、葉片展開(kāi)的健壯再生幼苗在人工氣候箱內(nèi)打開(kāi)瓶口，煉苗一周左右，再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶中取出再生苗，用無(wú)菌水沖洗附著在根表面的培養(yǎng)基，移栽至滅菌的蛭石中，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.6 培養(yǎng)條件

人工氣候箱溫度恒定保持（24±2）℃，光周期為16 h/d。培養(yǎng)間晝夜溫度為25℃/20℃，光周期為16 h/d，相對(duì)濕度70%～80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

將甜菜葉柄接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上5～7 d，葉柄開(kāi)始膨大，15～20 d后，葉柄切口處形成致密緊湊的綠色或黃綠色的愈傷組織 （圖1 B）。從表1結(jié)果可以看出，所選取的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基均可以誘導(dǎo)出愈傷組織，其中在MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)率最高，達(dá)到88.2%。再經(jīng)1～2次繼代后，部分愈傷組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷梢姿榈狞S綠色愈傷組織，后期研究發(fā)現(xiàn)，疏松易碎的黃綠色愈傷組織的分化率較高，而緊湊致密的愈傷組織則無(wú)法分化出不定芽。此外，隨著6－BA濃度的增大，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，褐化外植體增多，說(shuō)明過(guò)高濃度的6－BA會(huì)抑制愈傷組織的形成。因此，本研究將MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA為誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

圖1 甜菜的組織培養(yǎng)和植株再生Fig.1 Tissue culture and plant regeneration of sugar beet

2.2 愈傷組織的分化

將誘導(dǎo)出的疏松易碎的黃綠色愈傷組織輕輕地轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上。經(jīng)過(guò)3～5次繼代培養(yǎng)之后，可以看見(jiàn)少量淡綠色的松散的愈傷組織中長(zhǎng)出深綠色的小顆粒，部分愈傷組織上已經(jīng)有芽長(zhǎng)出（圖1 C）；繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，這些綠色小顆粒逐漸發(fā)育成不定芽，且周?chē)懈嗟牟欢ㄑ糠只鰜?lái)（圖1 D）。在此過(guò)程中，一些不定芽出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象。究其原因可能是細(xì)胞分裂素6－BA濃度過(guò)大，使得細(xì)胞分裂的速度超過(guò)了干物質(zhì)生產(chǎn)和積累的速度；也有可能是不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中繼代次數(shù)較多，愈傷組織或不定芽中積累了過(guò)量的激素，從而產(chǎn)生玻璃化苗。此外，有一些愈傷組織褐化后在其表面長(zhǎng)出灰白色的松散細(xì)胞團(tuán)，這類(lèi)愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)后依然不能分化，但含水量似乎并未減少。也有一些愈傷組織質(zhì)地更加堅(jiān)硬致密，多次繼代后也無(wú)法分化出不定芽，而且愈傷組織變得極為干燥，堅(jiān)硬。從表2可以看出，僅MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA和MS+5 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA上有不定芽生成，而在其他培養(yǎng)基上則沒(méi)有芽長(zhǎng)出。將細(xì)胞生長(zhǎng)素NAA的濃度提高至1 mg/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)分化培養(yǎng)基上仍然沒(méi)有不定芽生成。此外，MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA上的分化率為9.4%，高于MS+5 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA的3.1%。因此，本研究中將MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA作為誘導(dǎo)芽分化的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同濃度激素對(duì)甜菜愈傷組織分化的影響Table 2 Effects of different concentration of hormones on the callus differentiation of sugar beet

2.3 甜菜再生幼苗的生根培養(yǎng)與移栽

從基部切下長(zhǎng)至1～2 cm的不定芽，接種到生根培養(yǎng)基中。2～3次繼代后，幼根從無(wú)根苗基部長(zhǎng)出，繼續(xù)培養(yǎng)后，須根逐漸增多（圖1 E,F）。從表3可以看出，在所設(shè)計(jì)生根培養(yǎng)基中，僅MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上可以生根，生根率達(dá)到33.3%。

待主根木質(zhì)化且有一定數(shù)量的須根長(zhǎng)出之后，將組培瓶瓶蓋敞開(kāi)一小部分；1～2 d后，將瓶蓋再開(kāi)一部分，讓再生苗逐漸適應(yīng)自然環(huán)境。煉苗一周后，用無(wú)菌水將再生苗根部培養(yǎng)基沖洗干凈，移入采用1/8 MS浸泡的滅菌蛭石中。為了保持一定溫度和濕度，移栽再生苗的育苗盆使用保鮮膜進(jìn)行多層覆蓋。10～15 d的培養(yǎng)后，再生苗開(kāi)始長(zhǎng)出新的葉片，逐漸除去覆蓋的保鮮膜。45 d后，再生植株正常生長(zhǎng)（圖1 G）。

表3 不同生根培養(yǎng)基對(duì)甜菜不定芽生根的影響Table 3 Effects of different rooting media on adventitious shoot rooting of sugar beet

3 討論

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)體細(xì)胞胚途徑或器官發(fā)生途徑直接或間接獲得再生植株是生物技術(shù)育種、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交及基因轉(zhuǎn)化研究的基礎(chǔ)[18]。本研究前期曾參考席德慧[19]和郝秀英[20]等在甜菜組培和植株再生過(guò)程中的激素濃度，以甜菜“甘糖七號(hào)”下胚軸、子葉、真葉和葉柄為外植體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甜菜下胚軸在所設(shè)定的培養(yǎng)基上容易褐化，且材料來(lái)源有限；子葉雖然可以在培養(yǎng)基上形成愈傷組織，但形成的愈傷組織幾乎全部是緊湊致密型的愈傷組織，無(wú)法繼續(xù)分化出不定芽；真葉由于葉片較薄，在培養(yǎng)基上容易卷曲且傷口較小，形成愈傷組織的效果不佳。因此，本試驗(yàn)選取甜菜葉柄作為外植體，對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生過(guò)程進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，葉柄在MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上可以快速且高效地誘導(dǎo)出愈傷組織。誘導(dǎo)出的愈傷組織有兩種類(lèi)型：一類(lèi)是綠色致密且堅(jiān)硬的愈傷組織，這類(lèi)愈傷組織在繼代過(guò)程中不易褐化，隨著繼代次數(shù)的增加質(zhì)地更為堅(jiān)硬，但始終無(wú)法分化出不定芽；而另一類(lèi)為黃綠色的松軟易碎的愈傷組織，在繼代過(guò)程中容易受褐化影響，可以分化出大量芽點(diǎn)但整體分化率不高，可能是甜菜本身不定芽分化能力低造成的，這一結(jié)果也與Zhong等[11]和Kagami等[12]所得到的結(jié)果類(lèi)似。

不定芽的分化是甜菜組織培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。現(xiàn)有報(bào)道中誘導(dǎo)甜菜愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基在激素種類(lèi)和濃度大小方面均存在差異，通常是在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上獲得大量愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，在一定程度上增加了愈傷組織褐化的幾率。但也有研究表明，一些植物中愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)可以在含相同激素組合的培養(yǎng)基完成[22－23]。如李瑩等[22]以紅甜菜嫩莖為外植體，在含1 mg/L BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織并成功分化出不定芽；蘇彩霞等[23]以3種番茄的下胚軸為材料，分別在含有6－BA和IAA的同一種MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽，并最終獲得了再生植株。本研究在前期獲得大量愈傷組織后，參考郝秀英等[20]所報(bào)道的激素配比，在含0.5～3 mg/L 6－BA，0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽。遺憾的是，愈傷組織在上述培養(yǎng)基中未能分化出不定芽。然而，在愈傷組織繼代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，少量愈傷組織在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可以分化出不定芽。因此，在隨后不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中并未重新設(shè)計(jì)分化培養(yǎng)基，而是通過(guò)連續(xù)繼代的方法獲得了不定芽，不僅降低了愈傷組織褐化的概率，而且消除了愈傷組織轉(zhuǎn)接至新培養(yǎng)基上的適應(yīng)期，理論上縮短了不定芽的分化周期，加速了甜菜植株再生的過(guò)程。此外，研究發(fā)現(xiàn)，甜菜莖節(jié)和葉子預(yù)處理后培養(yǎng)在激素濃度合適的培養(yǎng)基上可以通過(guò)器官發(fā)生途徑形成再生植株[20]。然而，在本研究中不定芽的分化則需通過(guò)愈傷組織來(lái)形成，并未觀察到直接器官發(fā)生方式形成不定芽，產(chǎn)生不同結(jié)果的原因可能是本研究中未對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理，也可能是取材部位不同，外植體再生能力存在一定差異。

Zhong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜再生苗在MS和1/2 MS培養(yǎng)基上都可以生根，且在添加NAA后，1/2 MS培養(yǎng)基上的生根率遠(yuǎn)高于MS培養(yǎng)基，可達(dá)到70%。Hasino等[24]也以1/2MS為基本培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)出不定根，從而建立了甜菜遺傳轉(zhuǎn)化體系。在本研究中，甜菜再生苗在含有NAA的1/2MS培養(yǎng)基上并不能生根，這與之前研究中降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度可以提升大多數(shù)植物的生根能力的結(jié)論不一致[25]，可能是由于本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)生長(zhǎng)素濃度過(guò)小，未達(dá)到甜菜再生苗生根所需激素水平；亦或是所用甜菜品種基因型不同，生根能力不同所致。令人意外的是，甜菜再生苗可以在含0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上生根，生根率可達(dá)到33.3%，由此說(shuō)明基本培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度、激素種類(lèi)及濃度對(duì)生根均有影響。因此，在選擇生根培養(yǎng)基時(shí)需對(duì)上述因素進(jìn)行綜合考慮。

4 結(jié)論

本研究以甜菜葉柄為材料，建立了甜菜愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系。結(jié)果表明，甜菜葉柄在MS+4 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上可高效快速地脫分化形成愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)88.2%。但在愈傷組織的分化過(guò)程中仍存在不定芽誘導(dǎo)率較低等困難，在分化培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率最高僅為9.4%。此外，本研究還對(duì)不定芽的生根進(jìn)行了誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不定芽可以在含0.1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基成功生根，生根率達(dá)到33.3%；這為之后甜菜分子育種改良及基因功能探索提供了可能。

致謝：本研究所使用的甜菜種子由甘肅武威市三農(nóng)種業(yè)科技有限公司段生福先生無(wú)償提供，致以衷心謝意！