端木慧子 ，牛志新 ，李海英 *

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

甜菜是雙子葉藜科（Chenopodiaceae）甜菜屬（Beta）的二年生異花授粉作物，是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，供應(yīng)著世界上約35%的糖[1]。同時(shí)，甜菜也是發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良飼料以及新興的能源作物，具有重要的研究?jī)r(jià)值。目前，我國對(duì)于甜菜的研究多集中于生理、生化和表型的研究，分子水平的研究相對(duì)較少。近年來高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為研究者從全基因組水平篩選功能基因，培育優(yōu)質(zhì)甜菜品種提供了可能。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STPK）是一種特異催化蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)功能的酶。其重要的功能之一就是參與環(huán)境脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2－3]。目前，已經(jīng)有多個(gè)STPK在擬南芥、水稻、小麥等植物中被鑒定出在非生物脅迫的過程中起著重要的作用[4－8]。然而，全基因組水平上甜菜STPK家族的分析和功能預(yù)測(cè)研究相對(duì)較少。因此，本研究通過生物信息學(xué)的方法及工具，從全基因組的水平鑒定甜菜STPK，并從序列和蛋白互作水平對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的分析，為今后甜菜遺傳育種提供理論支持與優(yōu)質(zhì)基因資源。

1 材料與方法

1.1 甜菜STPK家族鑒定

利用HMMER[9]軟件構(gòu)建STPK家族的序列特征模型，并利用該模型在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中搜索可能的甜菜STPK家族成員，進(jìn)一步利用SMART（http://smart.embl－h(huán)eidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得甜菜STPK家族成員。

1.2 甜菜STPK家族系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ClustalX[10]對(duì)甜菜STPK進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 5.0軟件[11]建立甜菜STPK家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。所采用的方法為最大似然法（Maximum likelihood，ML）和最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony，MP），并將兩種方法的結(jié)果進(jìn)行整合，最終利用Bootstrap方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)（隨機(jī)1000次）。

1.3 甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫 （https://string－db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并利用MCL（Markov Clustering Algorithm）聚類算法識(shí)別網(wǎng)絡(luò)中的子網(wǎng)。通過agriGO[12]（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）數(shù)據(jù)庫對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜STPK家族鑒定與序列分析

利用HMMER軟件結(jié)合基因注釋與SMART數(shù)據(jù)庫，共在甜菜基因組中鑒定得到148個(gè)STPK。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，這148條序列所具有的保守結(jié)構(gòu)集中在第100個(gè)氨基酸到第500個(gè)氨基酸之間，共有11個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，與已知蛋白激酶結(jié)構(gòu)域相符[13]。

分別使用最大似然法（ML）和最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建甜菜STPK的系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇兩種方法共有的結(jié)構(gòu)進(jìn)行整合，最終獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹分為9個(gè)亞類，這些不同亞類中的基因具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可能行使不同的功能（圖1）。比如亞類I中共有13個(gè)成員，主要由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AFC和MHK及其異構(gòu)體組成，而亞類II主要包含WNK等蛋白激酶。

圖1 甜菜STPK家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of STPKs in sugar beet

圖2 甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein network of STPKs in sugar beet

2.2 甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并分析，共識(shí)別了8個(gè)子網(wǎng)（圖2）。值得注意的是，最大的子網(wǎng)是由 WNK8、SnRK2.8、SnRK2.3、SnRK2.7、SnRK2.2、SnRK2.5、SnRK2.1、SnRK2.4、OST1 和 HT1 等蛋白激酶構(gòu)成。其中，SnRK2蛋白激酶是植物中非常常見的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[14]，它屬于蔗糖非酵解型－1（SNF1）型，土壤中的鹽分或者脫落酸可以使SnRK2蛋白激酶激活，從而調(diào)控下游基因表達(dá)。因此，SnRK2蛋白激酶與植物抗逆境生存有很大關(guān)聯(lián)。

對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析的結(jié)果顯示，這些STPK家族成員主要富集在“細(xì)胞過程”、“代謝過程”、“發(fā)育過程”等生物學(xué)功能上（圖3），說明STPK家族參與了廣泛的生物學(xué)過程。值得注意的是，一些STPK家族成員顯著富集在了刺激響應(yīng)功能上，說明一些STPK參與植物的脅迫應(yīng)答過程。

圖3 甜菜STPK功能注釋Fig.3 Functional annotation of STPKs in sugar beet

3 討論

本研究以甜菜全基因組序列為基礎(chǔ)，通過HMMER方法進(jìn)行甜菜STPK家族鑒定。與傳統(tǒng)的BLAST方法相比，HMMER能夠更加準(zhǔn)確找到親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的同源序列。另外，本研究采用SMART數(shù)據(jù)庫對(duì)HMMER鑒定的STPK家族成員做進(jìn)一步的檢驗(yàn)，最大程度上確保了鑒定的甜菜STPK的全面性和準(zhǔn)確性。

通過多序列比對(duì)的方法對(duì)鑒定得到的甜菜STPK家族成員進(jìn)行序列特征分析，結(jié)果顯示鑒定得到的甜菜STPK家族成員均具有蛋白激酶所特有的11個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，再次證明了鑒定結(jié)果的可靠性。分別采用最大似然法（ML）和最大簡(jiǎn)約法（MP）兩種方法構(gòu)建進(jìn)化樹，并僅選取兩種方法結(jié)果中相同的部分構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并在構(gòu)建進(jìn)化樹過程中采用了BootStrap方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保了構(gòu)建進(jìn)化樹的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。

甜菜STPK蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，STPK之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，不同的STPK可能行使不同的功能。而功能富集分析的結(jié)果顯示，除了正常的生物學(xué)功能，一些STPK還參與了植物發(fā)育與刺激響應(yīng)過程。

4 結(jié)論

本研究從甜菜基因組中鑒定得到148個(gè)甜菜STPK家族成員，這些甜菜STPK家族成員分為9個(gè)亞類，每個(gè)亞類可能行使不同的功能。甜菜STPK互作網(wǎng)絡(luò)包括8個(gè)子網(wǎng)，網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)與發(fā)育和刺激應(yīng)答功能相關(guān)。本研究結(jié)果可為甜菜遺傳育種提供理論支持與基因資源。