黃秀芳 陶彥谷 張茹蘭 黃啟輝 (廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 50080)

阿爾茨海默病(AD)是中樞退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集沉積成老年斑是AD的病理特征〔1〕，在AD患者大腦病理切片中發(fā)現(xiàn)明顯的星形膠質(zhì)細胞(AS)增生，尤其是圍繞受損的神經(jīng)元周圍有強的AS反應(yīng)。AS具有對各種損害產(chǎn)生強烈反應(yīng)的特性，與神經(jīng)元細胞相互作用，維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，AS在AD的病理過程中呈現(xiàn)出清除Aβ的作用〔2〕，但隨著病程進展，Aβ能夠誘導(dǎo)AS增殖，產(chǎn)生致炎因子，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞損傷〔3〕，因此建立良好的AS培養(yǎng)模型對研究AD有重要作用。本研究探討Aβ25～35誘導(dǎo)AS增殖的合適濃度，并研究AS的體外培養(yǎng)，為研究藥物對AD的治療作用提供細胞模型的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生1 d內(nèi)的SPF級SD大鼠，體重5～6 g，為南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號:scxk粵2006-0015)

1.2 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(Eppendorf)公司;常溫臺離心機(Themo公司);超凈臺(阿爾泰實驗室設(shè)備有限公司);流式細胞儀(R＆D公司);熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)。

1.3 主要試劑 Aβ25～35、噻唑藍(MTT，sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-DETA(吉諾生物醫(yī)藥科技有限公司)，兔抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)多抗(Santa Cruz公司)，F(xiàn)TTC標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，青霉素-鏈霉素溶液(Gibco公司)，聚丙烯酰胺凝膠(SDS，廣州威佳科技有限公司)。Aβ25～35(1 mmol/L)儲存液、MTT、三聯(lián)溶解液配制5 mg Aβ25～35加入4.72 ml超純水中，250 mg MTT加入50 ml PBS溶液中，完全溶解，另外，10 g SDS、5 ml異丁醇和 0.1 ml HCl(1 mmol/L)，用雙氯水定容為100 ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝，Aβ25～35、MTT－20℃保存，三聯(lián)溶解液 4℃保存。

1.4 AS的體外原代培養(yǎng)〔4〕新生24 h的SD大鼠，冰凍低溫麻醉處死，乙醇浸泡5～10 s消毒后，在超凈臺取出完整大腦，在解剖顯微鏡下剔除蛛網(wǎng)膜、軟腦膜及血管，取出雙側(cè)大腦皮層，沖后轉(zhuǎn)移至盛有DMEM的離心管中，用移液管吹打10次，振蕩60 s后，先后用70 μm及20 μm孔徑過濾器各過濾兩遍，最終濾液加入20%胎牛血清和1% 雙抗溶液，吹打混勻，計數(shù)后以1×105的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中，飽和濕度、37℃培養(yǎng)，次日換成10% 胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，每2～3 d換液一次，每次換液前稍加振蕩，PBS溶液沖洗一遍。

1.5 細胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)細胞長滿80%～90%培養(yǎng)板底面時傳代，傳代前用PBS溶液沖洗兩遍，加入少許胰蛋白酶-DETA溶液消化3 min，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變圓時，加含血清的培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復(fù)吹打使細胞從培養(yǎng)皿底面脫落，收集細胞懸液，以4×105的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代細胞4～5 d融合。

1.6 流式細胞技術(shù)鑒定GFAP 取3代細胞，按上述方法制成單細胞懸液離心5 min，PBS溶液漂洗3次，制成濃度為以 1×106/ml的細胞懸液，取200 μl，加抗GFAP多抗 1 μl(鑒定組)，并設(shè)同型對照，冰浴30 min，離心棄上清，PBS充分洗滌，加FTTC標(biāo)記的羊抗兔IgG，避光反應(yīng)15 min，重懸細胞，進行流失細胞儀檢測

1.7 檢測不同濃度Aβ對AS增殖的影響 取3代細胞消化重懸，以每孔4×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h 后加入終濃度的 0、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200 μmol/L Aβ25～35(預(yù)先老化)，每組 5 孔，4 h后每孔加入20 μl的MTT(5 mg/L)，4 h后加入三聯(lián)溶解液100 μl終止培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜后，以空白對照組(僅加藥物、MTT溶液、三聯(lián)溶解液)調(diào)零，酶標(biāo)儀上585 mm測各孔吸光值(OD值)，分別計算各濃度的細胞增殖率。細胞增殖率(%)=各濃度OD值－空白組OD值/空白組OD值×100%)

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 細胞生長情況及流式細胞計數(shù)儀檢測AS比例24 h后，大部分細胞均已貼壁，光暈明顯;培養(yǎng)4～5 d后，細胞數(shù)目逐漸增多、舒展，部分細胞接觸融合;隨著培養(yǎng)時間的延長，AS的比例越來越高，7～8 d后，以AS為主的細胞可鋪滿整個皿底，達到90%的融合。傳代后的AS 6 h即可全部貼壁，胞突逐漸舒張;4～5 d長滿整個皿底，AS比例進一步增高;連續(xù)傳代3次，AS的胞體外形不規(guī)則，細胞鋪展明顯，成放射狀，細胞核多偏于胞體的一側(cè)，一般為橢圓形，胞質(zhì)豐富，密度較低。見圖1。

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)送檢細胞中幾乎均為GFAP陽性，GFAP表達陽性的細胞比例為(97.494±0.618)%，而同型對照組為(1.664±0.511)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 原代培養(yǎng)AS的生長情況(腦皮質(zhì)細胞，×40)

2.2 不同濃度Aβ25～35對AS增殖能力的影響 不同Aβ25～35濃度作用24 h，對AS增殖能力具有不同的影響(P＜0.01)，當(dāng) Aβ25～35濃度為 5～60 μmol/L時，AS的增殖率明顯高于0 μmol/L組(P＜0.01);當(dāng)Aβ25～35 濃度為 70、100、200 μmol/L 時，增殖率低于0 μmol/L 組，且在100、200 μmol/L 濃度時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中當(dāng) Aβ25～35濃度為20 μmol/L時，AS的增殖率最高。見表1。

表1 Aβ25～35對AS增殖能力的影響 (，n=5)

表1 Aβ25～35對AS增殖能力的影響 (，n=5)

與 0 μmol/L 組比較:1)P＜0.05

組別 OD值 增殖率(%)0 μmol/L 組 0.357±0.014 0.00±4.01 5 μmol/L 組 0.421±0.011 18.049±3.1301)10 μmol/L 組 0.443±0.009 24.271±2.5811)20 μmol/L 組 0.454±0.023 27.298±6.4751)30 μmol/L 組 0.451±0.015 26.401±4.3191)40 μmol/L 組 0.438±0.012 22.870±3.3081)50 μmol/L 組 0.422±0.012 18.217±3.3771)60 μmol/L 組 0.390±0.009 9.361±2.3981)70 μmol/L 組 0.356±0.016 －0.336±3.531 100 μmol/L 組 0.298±0.013 －16.536±3.5311)200 μmol/L 組 0.279±0.009 －21.917±2.5891)F/P值 103.107/0.000

3 討論

GFAP是AS的骨架蛋白，可作為特征性標(biāo)志物，作為AS的成熟標(biāo)志〔5〕，本實驗提示大多數(shù)細胞GFAP陽性，說明AS純度較高，電鏡下提示AS生長情況良好，這與本文采用震蕩渦旋的方法使細胞混懸為單細胞懸液，避免胰酶殘留影響細胞活力，其次采用不同孔徑的濾網(wǎng)濾過細胞原液，進一步去除成纖維細胞的干擾，還采用無黏附底物環(huán)境培養(yǎng)，以減少神經(jīng)元細胞干擾有關(guān)。

AD病理變化的實驗?zāi)Ｐ鸵恢笔茿D研究的難點，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為AD動物模型的制作和應(yīng)用提供了廣闊前景，但成本昂貴，Kerokoski等〔6〕證明低劑量的Aβ1～42作用 AS后，能夠促進 AS 增殖，F(xiàn)rozza等〔7〕研究證實，Aβ25～35與Aβ1～42誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷的程度相似，本實驗證明在 5～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)Aβ25～35作用24 h，對細胞沒有直接毒性，且對AS增殖具有促進作用，當(dāng)Aβ25～35濃度為20 μmol/L時，AS的增殖能力最強，故可采用 Aβ25～35 20 μmol/L，24 h建立Aβ誘導(dǎo)AS增殖模型，為研究防治 AD病提供實驗?zāi)Ｐ鸵罁?jù)。