費(fèi)洪新 李 林 趙 坤 柏青楊 韓麗君 沈 博 明 玥 張英博 興桂華 李春旭(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

阿爾茨海默病(AD)是常見的老年性疾病之一，其病理特征為神經(jīng)元外沉積 β-淀粉樣蛋白(Aβ)〔1〕，Aβ積累后誘導(dǎo)腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)活化，促進(jìn)炎癥介質(zhì)上調(diào)〔2〕，一旦Aβ產(chǎn)生和清除平衡破壞會(huì)引起血管毒性〔3〕，Aβ 清除異?？蓪?dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙〔4〕，伴有海馬血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化〔5〕。已經(jīng)證實(shí)Aβ由低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)1與晚期糖基化終產(chǎn)物(RAGE)受體介導(dǎo)清除〔6，7〕，RAGE/Aβ 參與調(diào)節(jié)從機(jī)體周邊到腦運(yùn)輸〔8〕，腦內(nèi)RAGE可增加核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β 表達(dá)〔9，10〕，最終促進(jìn) AD 的發(fā)生發(fā)展。前期研究顯示，補(bǔ)陽還五湯有效成分黃芪多糖可保護(hù)AD模型海馬組織〔11〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，補(bǔ)陽還五湯有效成分芒柄花黃素(FMN)可減弱 Aβ誘導(dǎo)HT22 細(xì)胞毒性〔12〕、調(diào)控新生血管形成〔13，14〕、降低糖尿病小鼠高血糖〔15〕等。目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道FMN用于AD小鼠，本實(shí)驗(yàn)分析FMN對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性C57小鼠，鼠齡2周齡，體重(20±2)g，42只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)李寶龍副教授、副主任提供〔動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(黑)2013-012〕。

1.2 儀器和試劑 透射電鏡(荷蘭公司)，Morris水迷宮(MWM)(安徽淮北正華公司)，RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國(guó)RT公司)，腦立體定位儀(成都儀器廠)，F(xiàn)MN(成都曼思特生物公司，16031005)，多奈哌齊(中國(guó)重慶植恩藥業(yè)公司，20141201)，LRP1(Santa Cruz公司，sc-25469)，RAGE(Boster公司，ba-1789)，酶聯(lián)免疫試劑盒IL-1β、TNF-α、IL-6細(xì)胞因子(南京建成生物工程研究所)，Aβ1～42(Sigma公司)。

1.3 AD模型的建立 除對(duì)照組外，參考文獻(xiàn)〔16，17〕方法造模，麻醉、固定、定位后，小鼠雙側(cè)腦室海馬區(qū)一次性注入 Aβ1～42(80 pmol/μl，10 μg);對(duì)照組雙側(cè)腦室內(nèi)無菌條件下注射10 μl生理鹽水。

1.4 分組與給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為FMN高劑量組(30.0mg/kg灌胃)、FMN 中劑量組(15.0 mg/kg灌胃)、FMN低劑量組(7.5 mg/kg灌胃)、多奈哌齊組(1 mg/kg灌胃)、模型組(生理鹽水灌胃)、對(duì)照組(生理鹽水灌胃)，每組7只，持續(xù)給藥30 d。

1.5 檢測(cè)學(xué)習(xí)能力 各組實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過灌胃結(jié)束后，采用MWM系統(tǒng)測(cè)定小鼠學(xué)習(xí)能力，該儀器水深20 cm，水溫(23±2)℃，平臺(tái)放于第Ⅳ象限，訓(xùn)練時(shí)間為第1～4天，60 s/次，若60 s未找到平臺(tái)，將小鼠放平臺(tái)15 s潛伏期計(jì)為60 s，第5天測(cè)定小鼠學(xué)習(xí)能力。

1.6 測(cè)定記憶能力 過程同1.5，第5天撤去MWM平臺(tái)，經(jīng)過MWM記錄軌跡并分析60 s小鼠找到平臺(tái)的游泳距離。

1.7 測(cè)定學(xué)習(xí)記憶保持能力 過程同1.5，第5天撤去MWM平臺(tái)，經(jīng)過MWM記錄軌跡并觀察60 s內(nèi)小鼠的目標(biāo)停留時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)。

1.8 觀察海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)心臟灌注器灌注后，取材海馬，經(jīng)過常規(guī)固定、脫水、包埋、切片等進(jìn)行觀察。

1.9 檢測(cè)海馬LRP1、RAGE表達(dá) 按照免疫組織化學(xué)法(IHC)常規(guī)制備石蠟切片，經(jīng)過脫蠟、滅活、封閉、加抗、顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片等，計(jì)數(shù)海馬平均光密度值(MOD)。

1.10 檢測(cè)海馬 IL-1β、IL-6、TNF-α含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死小鼠，取材海馬，經(jīng)勻漿、靜置、離心、分裝等，于450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(A)，按照常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附分析方法求得炎癥介質(zhì)含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)能力 小鼠潛伏期在1～5 d呈逐漸下降趨勢(shì)，與對(duì)照組第5天比較，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05);與模型組第5天比較，多奈哌齊組、FMN高劑量組、FMN高劑量組、FMN高、中劑量組潛伏期明顯縮短(P＜0.05)。見表1。

2.2 記憶能力 小鼠游泳距離在1～5 d呈逐漸下降趨勢(shì)，與對(duì)照組第5天比較，模型組游泳距離明顯增加(P＜0.05);與模型組第5天比較，多奈哌齊組、FMN高、中劑量組游泳距離明顯減少(P＜0.05)。見表2。

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d對(duì)照組 57．023 8±1．099 8 49．509 5±2．361 2 40．952 4±1．577 7 30．876 2±2．514 3 22．804 8±2．799 4模型組 57．128 6±0．975 7 50．100 0±2．884 6 48．428 6±3．155 4 41．409 5±3．393 7 41．161 9±4．215 71)多奈哌齊組 56．114 3±1．390 0 51．809 5±1．905 4 41．361 9±2．925 4 32．357 1±1．874 5 23．766 7±2．384 22)FMN 高劑量組 56．766 7±1．010 5 52．595 2±2．741 9 41．285 7±2．484 6 31．766 7±2．690 7 24．438 1±4．498 32)FMN 中劑量組 56．376 2±1．072 2 51．838 1±1．877 4 40．957 1±2．152 1 31．409 5±1．604 4 25．057 1±2．772 92)FMN 低劑量組 56．842 9±1．150 0 52．757 1±1．740 5 48．509 5±4．129 8 36．547 6±4．476 4 38．109 5±3．705 5

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，下表同

表2 各組撤去平臺(tái)后不同時(shí)間點(diǎn)記憶能力比較(，n=7，游泳距離，cm)

表2 各組撤去平臺(tái)后不同時(shí)間點(diǎn)記憶能力比較(，n=7，游泳距離，cm)

組別 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d對(duì)照組 1 189．624 8±51．512 2 1 036．207 6±54．081 9 891．913 8±99．298 0 652．790 5±65．455 9 540．406 2±81．882 8模型組 1 180．069 5±22．295 0 1 134．007 1±66．018 4 1 101．402 4±84．455 9 930．635 2±45．655 8 767．374 8±79．894 91)多奈哌齊組 1 194．508 1±41．851 7 1 022．766 7±99．109 0 936．255 2±70．103 8 703．162 4±91．476 6 628．737 6±63．802 62)FMN 高劑量組 1 191．115 7±25．088 7 1 022．209 5±86．861 9 969．654 8±80．872 0 756．026 2±119．378 7 604．744 3±41．916 62)FMN 中劑量組 1 167．068 1±40．282 4 1 032．011 4±90．389 3 982．152 4±66．051 5 731．331 9±91．828 1 601．234 3±57．815 32)FMN 低劑量組 5 1 181．251 9±30．062 5 1 006．328 1±38．473 5 1 087．658 1±107．205 0 898．355 7±62．993 6 728．937 6±89．002 9

2.3 學(xué)習(xí)記憶保持能力 與對(duì)照組比較，模型組目標(biāo)停留時(shí)間明顯縮短且跨平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05);與模型組比較，多奈哌齊組，F(xiàn)MN高、中劑量組目標(biāo)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)且跨平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P＜0.05)。見表3。

2.4 海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu) 對(duì)照組海馬毛細(xì)血管管壁較厚，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富;模型組海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管管壁薄，核固縮，細(xì)胞質(zhì)不豐富;多奈哌齊組，F(xiàn)MN高、中劑量組細(xì)胞核正常，細(xì)胞質(zhì)豐富;FMN低劑量組海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)欠佳。見圖1。

表3 各組目標(biāo)停留時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)比較(，n=7)

表3 各組目標(biāo)停留時(shí)間和跨平臺(tái)次數(shù)比較(，n=7)

組別 目標(biāo)停留時(shí)間(s) 跨平臺(tái)次數(shù)(次)對(duì)照組 21．428 6±3．283 7 5．285 7±1．799 5模型組 11．905 7±2．371 81) 2．571 4±0．975 91)多奈哌齊組 19．391 4±2．754 72) 4．571 4±1．511 92)FMN 高劑量組 19．874 3±2．433 12) 4．142 9±1．345 22)FMN 中劑量組 18．078 6±1．829 22) 4．285 7±1．112 72)FMN 低劑量組 12．915 7±2．154 4 3．142 9±0．690 1

2.5 海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平 與對(duì)照組比較，模型組海馬LRP1表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯升高 (P ＜0.05);與模型組比較，多奈哌齊組，F(xiàn)MN高、中劑量組小鼠海馬 LRP1明顯升高(P＜0.05)，RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯降低(P＜0.05)。見表 4。

圖1 各組海馬CA3區(qū)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡)

表 4 各組海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平(，n=7)

表 4 各組海馬 LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平(，n=7)

組別 LRP1 RAGE IL-1β(pg/ml) IL-6(ng/ml) TNF-α(pg/ml)對(duì)照組 0．366 4±0．070 6 0．262 9±0．045 6 156．583 3±41．602 6 6．258 9±0．896 7 826．564 6±93．191 4模型組 0．233 9±0．032 01) 0．377 5±0．055 61) 245．898 8±33．184 31) 9．144 8±1．165 81) 1 248．809 5±200．523 91)多奈哌齊組 0．329 1±0．053 42) 0．273 6±0．028 02) 166．166 7±34．548 42) 6．513 5±0．955 62) 883．911 6±123．621 02)FMN 高劑量組 0．333 9±0．037 72) 0．286 9±0．035 02) 173．190 5±44．257 32) 7．066 8±0．999 32) 910．782 3±129．303 52)FMN 中劑量組 0．328 4±0．043 02) 0．276 2±0．039 12) 161．761 9±51．026 82) 7．659 9±1．015 22) 927．517 0±105．098 22)FMN 低劑量組 0．242 9±0．038 0 0．344 1±0．032 2 217．476 2±45．407 4 8．888 4±0．933 4 1 108．537 4±107．057 1

3 討論

本文結(jié)果表明AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退，F(xiàn)MN高、中劑量有效改善AD小鼠學(xué)習(xí)能力、記憶能力。FMN高、中劑量可改善AD小鼠海馬學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵區(qū)域——CA3區(qū)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)，以此減弱小鼠海馬的損傷。FMN高、中劑量可改善小鼠學(xué)習(xí)記憶和毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)，這與小鼠海馬LRP1、RAGE、IL-1β、IL-6、TNF-α水平改善有關(guān)。綜上，F(xiàn)MN通過改善AD小鼠海馬Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和炎癥介質(zhì)水平來改善學(xué)習(xí)記憶能力和海馬毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)。