許玲玲 魯明軍 郭 濤 蘇 楠 王 敏 吳琳英 羅福全 耿慶山 黃偉青(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 5020)

晚期慢性腎臟病患者由于胃腸功能和腸道微生態(tài)的紊亂〔1，2〕，導(dǎo)致多種尿毒癥毒素蓄積，主要包括硫酸吲哚酚(IS)、硫酸對(duì)甲酚等。尿毒素IS能夠引起心血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、凋亡、動(dòng)脈鈣化，引起心血管事件發(fā)生率升高，從而導(dǎo)致患者死亡率明顯升高〔3，4〕。目前研究表明，尿毒素IS能夠通過(guò)氧化應(yīng)激、激活核因子(NF)-κB通路等損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致心功能不全及血管硬化等病理改變〔5，6〕。因此，抑制尿毒素IS介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有重要意義。

丹參酮ⅡA在中藥丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)中的含量較高，有較強(qiáng)的生理活性，是丹參主要有效成分之一，具有天然抗氧化、抗炎和心血管藥理保護(hù)作用，廣泛用于心血管病及尿毒癥患者治療〔7，8〕。尿毒癥患者血清IS水平波動(dòng)在50～240 μg/ml，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道〔4〕100 μg/ml IS 可引起內(nèi)皮細(xì)胞明顯損傷，本研究擬采用100 μg/ml IS進(jìn)行研究，旨在觀察IS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及丹參酮的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVECs)購(gòu)自美國(guó)ATCC。IS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，丹參酮ⅡA購(gòu)自上海融禾生物科技公司，胎牛血清(FBS)、胰酶、RIPM1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DAPI染色液、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司，Annexin/PI雙染試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將內(nèi)皮細(xì)胞置于含10%FBS及青霉素、鏈霉素各 100 U/ml的 RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng);細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)后2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 內(nèi)皮細(xì)胞以適當(dāng)密度轉(zhuǎn)種，實(shí)驗(yàn)前換用0.5%RPMI1640培養(yǎng)液同步16 h后。加入不同濃度的丹參酮ⅡA和(或)100 μg/ml的IS，于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為正常組、IS 組、IS+丹參酮ⅡA 不同濃度(2 μg/ml和10 μg/ml)組。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 觀察各組刺激細(xì)胞12、24 h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，奧林巴斯EX71倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.5 培養(yǎng)上清LDH檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)上清至10 ml離心管，1 200 r/min離心5 min，吸取上清，按照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組細(xì)胞上清LDH水平。

1.6 DAPI法行細(xì)胞核染色 細(xì)胞傳代至6孔板，同步后加刺激孵育至24 h、4%多聚甲醛4℃固定20 min，0.5%Triton X-100透膜10 min，PBS洗滌2次。加入DAPI染色液，覆蓋細(xì)胞表面，避光孵育20 min，PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核情況。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞傳代至6孔板，同步后加刺激孵育至所需時(shí)間，吸棄培養(yǎng)液，無(wú)乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細(xì)胞，終止消化，離心，PBS洗滌1次，離心，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC工作液，混勻，加入5 μl PI工作液，避光，室溫孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 與正常組相比，IS組刺激12 h后內(nèi)皮細(xì)胞明顯損傷，細(xì)胞變性，至24 h損傷加重，細(xì)胞變圓、皺縮。2 μg/ml丹參酮ⅡA對(duì)IS組誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并不明顯，但10 μg/ml明顯改善細(xì)胞學(xué)形態(tài)變化，細(xì)胞變性減輕，細(xì)胞皺縮、變圓情況好轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組12、24 h細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.2 丹參酮ⅡA可抑制IS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞LDH釋放

與正常組比較，IS組12 h后可引起內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH釋放明顯增加，24 h LDH水平進(jìn)一步上升，呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞損傷(P＜0.05)。IS+丹參酮ⅡA 2 μg/ml組24 h培養(yǎng)液上清LDH水平較IS組明顯下降(P＜0.05)，IS+丹參酮ⅡA 10 μg/ml組 12、24 h 培養(yǎng)液上清LDH水平較IS組均有明顯下降(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組培養(yǎng)上清LDH釋放量比較(，n=3，U/L)

表1 各組培養(yǎng)上清LDH釋放量比較(，n=3，U/L)

與正常組比較:1)P＜0.05;與IS組比較:2)P＜0.05

組別 12 h 24 h正常組 4.1±0.6 4.7±0.7 IS 組 11.4±1.11) 14.5±1.81)IS+丹參酮ⅡA 2 μg/ml組 9.2±1.3 11.2±1.12)IS+丹參酮ⅡA 10 μg/ml組 7.8±0.82) 9.4±0.92)

2.3 丹參酮ⅡA可抑制IS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 DAPI法染色后在熒光顯微鏡下觀察，正常組細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，形態(tài)飽滿，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)亮。結(jié)果顯示IS組內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，而IS+丹參酮ⅡA 10 μg/ml組治療后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可明顯改善，見(jiàn)圖2。

圖2 DAPI法檢測(cè)細(xì)胞核情況(×200)

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(40.3%±4.5%)顯著高于正常組(4.2%±0.5%，P＜0.01)，IS+丹參酮ⅡA 10 μg/ml組(24.6%±3.0%)顯著高于正常組，但顯著低于IS組(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

3 討論

尿毒素蓄積是晚期慢性腎臟病患者發(fā)生心血管事件的重要原因之一，尋找有效措施，抑制尿毒素如IS等的生物學(xué)效應(yīng)具有重要意義。丹參是中醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中的理血藥，丹參酮A是丹參主要有效成分之一?，F(xiàn)代研究表明丹參酮ⅡA具有顯著的抗氧化及心血管保護(hù)作用，在尿毒癥患者及心血管病患者中運(yùn)用廣泛〔7〕。丹參酮ⅡA能夠有效減少DNA加成物的細(xì)胞毒性，消除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物——脂類(lèi)自由基，從而有效保證線粒體呼吸功能。丹參酮ⅡA能夠保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而體現(xiàn)出抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。而通過(guò)靜脈注射丹參酮ⅡA，能夠有效降低心臟體積、左心室壁張力，降低心肌耗氧量，有效的治療缺血性冠心病，同時(shí)能夠縮小心肌梗死范圍〔9～11〕。

本研究結(jié)果表明，尿毒素IS能夠引起HUVECs發(fā)生明顯損傷變性，上清LDH釋放量明顯增多，細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。丹參酮ⅡA能夠減輕IS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷變性，細(xì)胞凋亡率較單純IS組也明顯減輕。丹參酮ⅡA對(duì)晚期慢性腎臟病患者的心血管有保護(hù)作用，但治療作用的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。