胡志萍 甘 寧 陳煥朝 李澤浩 江建平 付皓云(湖北省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖北 武漢 430079)

肺癌的發(fā)病率與死亡率均呈上升趨勢〔1〕，癌癥的預(yù)防和治療已成為臨床迫切需要解決的問題之一〔2〕。手術(shù)或放化療雖然能夠控制腫瘤進(jìn)展，但副作用較大，中醫(yī)藥在抗腫瘤研究治療方面有顯著效果，特別在抑瘤、增效減毒、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面，彌補(bǔ)了肺癌手術(shù)、放化療治療的不足〔3〕。白龍靈沙湯在臨床中應(yīng)用多年，是對非小細(xì)胞肺癌的治療有效方劑，前期研究表明白龍靈沙湯可提高患者的免疫功能〔4〕，本研究采用免疫組化的方法，分析白龍靈沙湯對小鼠Lewis肺癌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP)-2及微血管密度(MVD)表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，體重(20±2)g，由湖北省實驗動物研究中心提供。所有動物均飼養(yǎng)于清潔級動物房，實驗過程中動物自由攝食和飲水，室溫20～25℃，濕度40%～70%。

1.2 藥物及試劑 白龍靈沙湯藥物組成(成人1日劑量):白英 30 g，龍葵 30 g，靈芝 10 g，沙參 15 g，補(bǔ)骨脂10 g;將中藥浸泡0.5 h后煮沸煎制約0.5 h，紗布過濾后文火煎制，濃縮濾液，使含生藥3.333 g/ml;兔抗-TIMP-2抗體、兔抗-bFGF抗體、兔抗-MMP-2抗體、兔抗-CD34抗體均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供(貨號分別為 bs-0416R、bs-0217R、bs-20706R、bs-0646R)。

1.3 儀器 正置顯微鏡(OLYMPUS公司)，石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)，攤片機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司)，IMS圖像分析系統(tǒng)(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

1.4 分組 40只雄性C57BL/6小鼠在實驗室穩(wěn)定條件下飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分成模型組，白龍靈沙湯高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 Lewis肺癌模型建立 無菌條件下操作，取傳代好的帶瘤小鼠的實體瘤塊，用剪刀剪成小碎塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加生理鹽水(1∶1.5)磨成勻漿，計數(shù)用2.5 ml漿液中的瘤細(xì)胞，用生理鹽水研磨并調(diào)整細(xì)胞數(shù)到1×107/ml，每只0.2 ml用右腋部皮下接種。

1.6 給藥方法 各組于腫瘤接種后次日開始給藥。白龍靈沙湯高、中、低劑量組分別按白龍靈沙湯成人日推薦劑量的20倍、10倍、5倍換算給藥量，即高劑量組33.33 g·kg－1·d－1，中劑量組 16.67 g·kg－1·d－1，低劑量組8.33 g·kg－1·d－1。模型組予等體積雙蒸水灌胃，1次/d，連續(xù)28 d。末次給藥24 h后取材進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.7 一般情況觀察 觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動狀況、對刺激的反應(yīng)、體重下降幅度、食欲和脫毛等指標(biāo)。

1.8 瘤重、抑瘤率檢測 末次給藥24 h后將小鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫瘤體后稱重(W)，計算抑瘤率(I):I=(模型組W－治療組W)/模型組W×100%。

1.9 免疫組化染色法檢測MMP-2和TIMP-2表達(dá)瘤體取下后經(jīng)甲醛固定48 h，梯度酒精脫水、浸蠟，石蠟包埋切片4張，切片厚度4 μm。切片脫蠟、水化。水浴法進(jìn)行抗原修復(fù)，pH6.0，檸檬酸緩沖液加熱至95～99℃，放入切片30 min，然后室溫下靜置20 min，取出切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗待用;顯色劑顯色。MMP-2和TIMP-2均以血管內(nèi)皮及間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為其陽性細(xì)胞。每張切片中取具有陽性顆粒數(shù)目最多的5個間質(zhì)區(qū)視野(400×)，用IMS圖像分析系統(tǒng)定量檢測陽性顆粒的面積、平均光密度來表示其在瘤體中的表達(dá)量。

1.10 免疫組化染色法檢測MVD表達(dá) 微血管檢測用抗細(xì)胞黏附分子CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，以內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒的微血管為陽性微血管。結(jié)果判斷:在低倍視野內(nèi)(100×)找到腫瘤組織內(nèi)MVD最高的區(qū)域，然后在高倍視野內(nèi)(400×)通過計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在監(jiān)視器上計數(shù)微血管的數(shù)目，凡呈現(xiàn)棕色單個細(xì)胞或細(xì)胞簇者均作為1個血管計數(shù)單位，管腔面積大于8個紅細(xì)胞直徑的血管不計數(shù)。每張切片在400倍視野下計數(shù)5個視野，取平均值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差檢驗齊性者用LSD法，方差不齊者用Games-Howell法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 各組小鼠接種前及給藥前一般情況無差異，各受試小鼠自接種腫瘤后均出現(xiàn)不同程度的生長。模型組腫瘤體生長較快，高劑量組生長最慢。給藥7 d后模型組和低劑量組逐漸出現(xiàn)精神萎靡，對外界刺激反應(yīng)下降，活動減少，進(jìn)食量有所減少，皮毛光澤度不佳。至給藥28 d實驗結(jié)束時，模型組小鼠活動進(jìn)一步減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，每日進(jìn)食量少，喜扎堆生活，體質(zhì)量下降，毛色干燥晦暗無光澤甚至干枯脫落。高劑量組小鼠活動無明顯減少，對外界刺激反應(yīng)較為敏感，每日進(jìn)食量有一定減少但不明顯，毛色相對較有光澤。中、低劑量組表現(xiàn)差不多。整個實驗中無死亡。

2.2 各組W、I比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組平均W均一定程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而與白龍靈沙湯低劑量組相比，白龍靈沙湯中、高劑量組明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。白龍靈沙湯中、高劑量組平均I高于白龍靈沙湯低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組W、I比較(，n=10)

表1 各組W、I比較(，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01;與白龍靈沙湯低劑量組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;下表同

組別 W(g) I(%)模型組 8.49±1.63 －白龍靈沙湯高劑量組 3.08±0.711)3) 62.92±13.153)白龍靈沙湯中劑量組 4.03±0.861)2) 52.03±8.642)白龍靈沙湯低劑量組 5.87±1.131) 45.76±9.33

2.3 各組MMP-2表達(dá)比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組MMP-2表達(dá)陽性面積、平均光密度均顯著降低(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 各組MMP-2、TIMP-2、MVD表達(dá)比較(，n=10)

表2 各組MMP-2、TIMP-2、MVD表達(dá)比較(，n=10)

組別 MMP-2TIMP-2陽性面積(mm2) 平均光密度/IOD 陽性面積(mm2) 平均光密度/IOD MVD(mm2)模型組 6 015.3±1031.2 0.369±0.059 1 649.3±294.5 0.195±0.038 87.16±16.19白龍靈沙湯高劑量組 3 017.2±493.61)3) 0.208±0.0311)3) 3 397.5±681.71)3) 0.307±0.0571)3) 46.16±8.681)3)白龍靈沙湯中劑量組 3 291.8±501.61)3) 0.221±0.0381)3) 3 164.2±583.41)2) 0.289±0.0421)2) 49.22±9.051)3)白龍靈沙湯低劑量組 4 371.6±783.11) 0.291±0.0451) 2 894.6±520.61) 0.271±0.0491) 53.64±10.421)

2.4 各組TIMP-2表達(dá)比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組TIMP-2表達(dá)陽性面積、平均光密度顯著升高(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.5 各組MVD表達(dá)比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組MVD均顯著降低(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組一定程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2 討論

肺癌在全球總體發(fā)病率已位居各類癌癥之首，在我國肺癌發(fā)病率居惡性腫瘤之首，其中男性為第一位，女性為第二位〔5〕。祖國醫(yī)學(xué)對于肺癌的治療積累了豐富的經(jīng)驗，在改善肺癌患者的生活質(zhì)量、延長患者的生存期方面有明顯優(yōu)勢。白龍靈沙湯方中白英味甘、苦，性寒，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、利水消腫之功效;龍葵味苦性寒，具有清熱解毒、活血消腫的功效;靈芝味甘，性平，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功效;沙參味甘微苦，性微寒，具有養(yǎng)陰清肺、益胃生津的功效;補(bǔ)骨脂味苦，性辛溫，具補(bǔ)腎健脾納氣的功效，諸藥共奏扶正消瘤之效。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，受諸多因素影響。近年研究發(fā)現(xiàn)，實體癌的生長和轉(zhuǎn)移需要持續(xù)的血管生成，有關(guān)腫瘤血管生成與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等關(guān)系已引起許多學(xué)者的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)〔6～8〕MVD 與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后等關(guān)系密切，是一個反映惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要參數(shù)。

腫瘤細(xì)胞及微環(huán)境分泌的生物因子在腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。研究表明，腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移首要條件為腫瘤細(xì)胞必須具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力〔9，10〕。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，其中 MMP-2是 MMPs家族中的關(guān)鍵作用因子〔11，12〕，研究表明〔13，14〕，MMP-2 和 TIMP-2 可能均參與了非小細(xì)胞肺癌新血管生成的調(diào)節(jié)。

本實驗中模型組小鼠進(jìn)食、活動、體質(zhì)、體重、對外界刺激等一般精神狀況較差，而各治療組小鼠一般狀況優(yōu)于模型組，且呈劑量相關(guān)，高劑量組與給藥前變化不大，與臨床〔4〕相吻合。

本實驗結(jié)果表明，肺癌的發(fā)生是一個極其復(fù)雜的過程，白龍靈沙湯作為復(fù)方制劑對于肺癌的作用可能是多方面的，本實驗從對肺癌組織中MMP-2、TIMP-2及MVD的影響方面探討了白龍靈沙湯的抑瘤作用，對該方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。