杜媛鯤 米 源 廖海江 王 雷 (河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，河北 石家莊 05007)

食管癌分為食管鱗癌和食管腺癌兩種病理類型，近年來，我國雖然以食管鱗癌為主，但隨著人們生活水平的提高，食管腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢〔1〕，全世界新增食管腺癌病例中有18%來自中國〔2〕。早期食管腺癌無明顯癥狀，當(dāng)確診時(shí)多數(shù)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，即使采取以手術(shù)為基礎(chǔ)的放化療綜合治療，五年生存率并沒有顯著提高。因此，應(yīng)進(jìn)一步了解食管腺癌的生物學(xué)行為，為食管腺癌的治療提供新的依據(jù)。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是近年來腫瘤領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一，與肝癌〔3〕，胰腺癌〔3〕、肺腺癌〔4〕、前列腺癌〔5〕等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，其中Gli作為Hh通路下游的核心組分在信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮核心調(diào)控作用，但其在食管腺癌中發(fā)揮的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。

脂磷酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)〔6〕，并且近年來研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Hh信號(hào)通路可通過與PI3K/AKT信號(hào)通路交叉調(diào)控促進(jìn)腫瘤進(jìn)展〔7～9〕，但在食管腺癌組織中Hh信號(hào)通路是否通過PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用及如何影響該信號(hào)通路尚缺乏有效證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過研究人食管腺癌細(xì)胞系OE33中Gli表達(dá)和PI3K/AKT通路的相互關(guān)系，初步探討腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，為食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人食管腺癌細(xì)胞系OE33購自英國Sigma-Aldrich公司，GANT61購自美國Selleckchem公司，N-Shh蛋白購自美國EBioscience公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Corning公司，胰酶胎牛血清購自美國Gemini公司，Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠Taqman基因表達(dá)預(yù)混液購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Gli1引物及探針、Gli2引物及探針、β-catenin引物及探針、NCadherin引物及探針、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物及探針購自美國生命技術(shù)公司，蛋白酶抑制劑購自德國羅氏公司，M-PER培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取試劑、Pierce-BCA蛋白分析試劑盒購自美國賽默飛公司，Tris/甘氨酸/電泳緩沖液購自美國伯樂公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自美國Thermo-Pierce公司，β-catenin鼠抗人單克隆抗體Gli1兔抗人多克隆抗體購自美國abcam公司、AKT兔抗人單克隆抗體和p-AKT兔抗人單克隆抗體(Ser473)購自美國cell signaling公司，Gli2鼠抗人單克隆抗體、N-Cadherin兔抗人單克隆抗體和GAPDH鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，cDNA合成試劑盒。

1.1.2 主要儀器 NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)，ELX800多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)，ABI 7900HT高通量熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) OE33細(xì)胞均培養(yǎng)于10%胎牛血清、青-鏈霉素各100 mg/ml的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)基中，于恒定濕度95%、恒定溫度37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 將培養(yǎng)瓶中對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，離心和細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔0.1×106鋪于12孔板，待第2天細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基并加入GANT61(15 μmol/L)，同時(shí)設(shè) N-Shh 組(0.5 mg/ml)、GANT61＆N-Shh 組 (15 μmol/L GANT61 處理細(xì)胞30 min后0.5 mg/ml N-Shh處理細(xì)胞24 h)和二甲基亞砜(DMSO)組(對(duì)照組)，以上方法處理細(xì)胞24 h后按照總RNA提取試劑盒說明書方法提取RNA，將樣本經(jīng)NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計(jì)檢測總RNA濃度，按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，然后用無R-Nase水稀釋10倍后于每孔加 cDNA 4.5 μl、Gli1、Gli2、β-catenin、N-Cadherin 和GAPDH各自的引物及探針0.5 μl及Taqman基因表達(dá)預(yù)混液 5 μl，反應(yīng)體系共計(jì) 10 μl/孔，加樣在 384 孔板上，于 PCR 儀中在 95℃、10 s，60℃、10 s，72℃、10 s的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR檢測，共40個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western印跡 同樣方法設(shè)GANT61組，N-Shh組、GANT61＆N-Shh組和DMSO組。24 h后常規(guī)收集每組樣本的總蛋白提取液，BCA法測定樣本的總蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠中以10 μg每道蛋白上樣，在200 V、40 min的反應(yīng)條件下經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)進(jìn)行電泳。冰水浴聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜。TBST洗膜，5% 脫脂奶粉/TBST液封膜1 h，加入一抗，一抗工作液濃度:Gli1(1∶1 000)，Gli2(1 ∶250)，β-catenin(1 ∶10 000)，N-Cadherin(1 ∶250)、p-AKT(1 ∶1 000)，AKT(1 ∶1 000)，GAPDH(1 ∶20 000)，4℃孵育過夜。第2天更換二抗，二抗工作濃度均為1∶20 000，室溫孵育1 h。ECL試劑顯色后于暗室X線曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將matrigel從－80℃冰箱中取出置于4℃待其融化，按照1∶4比例用培養(yǎng)基稀釋后放置于培養(yǎng)箱待固化。實(shí)驗(yàn)分為4組:GANT61組、N-Shh組、DMSO組、GANT61＆N-Shh組。收集處理后的OE33細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液重懸在無血清培養(yǎng)液中，上室加入包含7.5×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液100 μl，下室加入含10%血清的培養(yǎng)液500 μl，注意防止大氣泡的產(chǎn)生，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后經(jīng)固定、染色后在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野，觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 Gli1、Gli2、β-catenin、N-cadherin mRNA表達(dá)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=211.273，P=0.000;F=688.096，P=0.000;F=369.842，P=0.000;F=872.859，P=0.000)。其中GANT61作用于 OE33細(xì)胞24 h后導(dǎo)致 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)mRNA的表達(dá)水平顯著低于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與DMSO組相比，N-Shh組可以顯著上調(diào)腫瘤細(xì)胞Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)的 mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與DMSO組相比，GANT61＆N-Shh組可以部分下調(diào)腫瘤細(xì)胞 Gli1(P=0.001)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)的mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GANT61＆N-Shh組與GANT61組相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、β-catenin(P=0.002)和 N-Cadherin(P=0.000)的mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各基因表達(dá)水平

2.2 Western 印跡結(jié)果 Gli1、Gli2、p-AKT、β-catenin、N-cadherin蛋白表達(dá)各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=492.076，P=0.000;F=2 607.524，P=0.000;F=2 414.111，P=0.000;F=7 669.963，P=0.000;F=2 565.358，P=0.000);AKT蛋白表達(dá)各組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.190，P=0.167)。GANT61處理OE33細(xì)胞 24 h，后 Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.167)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表達(dá)均顯著低于DMSO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與DMSO組相比，N-Shh處理組Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和N-cadherin(P=0.000)蛋白表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GANT61＆N-Shh組與DMSO對(duì)照組相比可以部分下調(diào)Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-cadherin(P=0.000)蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GANT61＆N-Shh組與GANT61組相比，Gli1(P=0.000)、Gli2(P=0.000)、p-AKT(P=0.000)、β-catenin(P=0.000)和 N-Cadherin(P=0.000)蛋白表達(dá)均高于GANT61組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 040.927，P=0.000):與DMSO組穿膜細(xì)胞數(shù)(154±3.06)比較，GANT61組穿膜細(xì)胞數(shù)(84±1.53)明顯減少(P=0.000)，N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)(173±2.00)較 DMSO組明顯增多(P=0.000)，GANT61＆N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)(106±4.16)較 DMSO組減少(P=0.000)，GANT61＆N-Shh組穿膜細(xì)胞數(shù)較GANT61組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖2 Western印跡方法檢測OE33中Gli1、Gli2、p-AKT、AKT、β-catenin和N-cadherin蛋白表達(dá)

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組OE33細(xì)胞侵襲能力

3 討論

Hh信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、器官成熟的過程中起著非常重要的作用，但當(dāng)胚胎成熟后此通路將被抑制〔10〕。Hh信號(hào)通路的異常激活已證實(shí)與許多惡性腫瘤(如胃癌)的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)〔11，12〕。經(jīng)典的 Hh通路是過度表達(dá)的Shh結(jié)合跨膜受體Ptch，解除了Ptch對(duì)Smo的抑制作用，使其將信號(hào)傳遞給核轉(zhuǎn)錄因子Gli，活化Gli1和Gli2。Gli1是Hh通路重要的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)Hh通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其通路的過度激活可引起細(xì)胞過度增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。由于Gli在Hh信號(hào)通路中發(fā)揮著承上啟下的核心作用，因此針對(duì)Gli為靶點(diǎn)的治療可以對(duì)Hh通路進(jìn)行精確的調(diào)控〔13，14〕。PI3K 在細(xì)胞增殖/凋亡等許多細(xì)胞進(jìn)程中起著非常重要的作用〔15～17〕。EMT是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，通過EMT過程，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性并且細(xì)胞之間失去黏附功能，增加了間皮細(xì)胞的特性，導(dǎo)致細(xì)胞更容易侵襲轉(zhuǎn)移〔18〕。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)記之一，在上皮細(xì)胞來源的腫瘤中出現(xiàn)N-cadherin高表達(dá)是EMT的重要特征，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為判斷預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)〔19，20〕。β-catenin也被認(rèn)為是 EMT 過程重要的標(biāo)記物之一，而且有研究表明肺癌組織中Gli1和βcatenin高表達(dá)呈正相關(guān)，應(yīng)用重組Shh蛋白激活Hh通路可以促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移〔21，22〕。Yoo 等〔23〕已發(fā)現(xiàn)在胃癌中Shh可以通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)EMT過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，本實(shí)驗(yàn)選取Gli1和Gli2的特異性抑制劑GANT61和Shh/Gli通路激活劑N-Shh對(duì)食管腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究，初步探討Gli過度表達(dá)是否通過活化PI3K通路進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞EMT進(jìn)程并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GANT61可以明顯下調(diào)OE33細(xì)胞的Gli1、Gli2基因表達(dá)以及EMT重要標(biāo)記物N-cadherin和β-catenin的基因表達(dá)。從蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)GANT61可以明顯下調(diào) Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin蛋白表達(dá)，AKT蛋白表達(dá)沒有顯著變化。侵襲實(shí)驗(yàn)也更進(jìn)一步證實(shí)抑制Gli的表達(dá)可以下調(diào)食管腺癌細(xì)胞的侵襲能力，分析其原因可能是GANT61通過降低PI3K/AKT的磷酸化水平下調(diào)EMT進(jìn)程，而NShh可以明顯上調(diào)腫瘤細(xì)胞的Gli1、Gli2、N-cadherin、β-catenin基因和蛋白表達(dá)以及p-AKT蛋白表達(dá)，但對(duì)AKT蛋白表達(dá)沒有影響，表明N-Shh可以通過活化Shh/Gli通路上調(diào)p-AKT和EMT指標(biāo)的表達(dá)。為了更好理解Shh/Gli通路和p-AKT之間的關(guān)系，我們采取了救援實(shí)驗(yàn)，既先應(yīng)用GANT61抑制Gli的表達(dá)后再應(yīng)用N-Shh激活Shh/Gli通路觀察相應(yīng)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示 Gli1、Gli2 、p-AKT、N-cadherin、β-catenin 等蛋白表達(dá)得到部分恢復(fù)，說明Shh/Gli通路和PI3K/AKT通路之間是相互關(guān)聯(lián)的，可能是PI3K/AKT信號(hào)通路在Shh信號(hào)通路調(diào)控食管腺癌細(xì)胞的EMT過程中可能發(fā)揮著重要作用，Gli通過活化PI3K/AKT通路進(jìn)而上調(diào)N-cadherin、β-catenin蛋白表達(dá)，促進(jìn)EMT進(jìn)程。

綜上所述，食管腺癌的EMT過程受多通路、多因子相互調(diào)控的作用。本研究初步探討了Gli在食管腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在食管腺癌中異常活化的Shh/Gli通路可通過調(diào)控PI3K/AKT通路促進(jìn)EMT過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。