劉 瑤 韓 影 趙雅寧 周 娜 (華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北 唐山 063000)

缺血性腦卒中是臨床的常見病和多發(fā)病。腦缺血后處理(CIP)是指在缺血再灌注后一定時間內(nèi)，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使組織對缺血產(chǎn)生耐受性〔1〕。CIP是缺血再灌注損傷較有力的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，在臨床上缺血性心、腦及外周血管疾病的防治具有良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞周期指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束開始到下一次有絲分裂結(jié)束為止所經(jīng)歷的整個序列過程。張貴斌等〔2〕在腦缺血再灌注大鼠模型中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期參與神經(jīng)元壞死的過程。已有研究發(fā)現(xiàn)CIP可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)，修復(fù)損傷的心肌組織〔3〕。但CIP對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用是否與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)，目前報道甚少。細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵成分，CyclinD1和CDK4的表達(dá)是評估缺血神經(jīng)元是否進(jìn)入病理狀態(tài)細(xì)胞周期的關(guān)鍵指標(biāo)〔4〕。本文通過檢測 CyclinD1和CDK4的表達(dá)，探究CIP腦保護(hù)的作用，為缺血性腦卒中的治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級健康雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量300～350 g，購自北京維通利華實驗動物中心，于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心飼養(yǎng)。在模型制造之前讓大鼠適應(yīng)7 d環(huán)境，自由進(jìn)食飲水，溫度22～26℃，濕度40%～70%，空氣壓力梯度20 Pa。將96只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注模型組(CIR組)、CIP組。

1.2 主要試劑 CyclinD1兔抗鼠多克隆抗體、CDK4兔抗鼠多克隆抗體和二抗(山羊抗兔)由武漢博士德生物工程有限公司提供，Nikon攝影生物光學(xué)顯微鏡購自日本株式會社尼康，伯樂電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)來自美國Bio-Rad公司。

1.3 動物模型制作 使用四血管閉塞法(4-VO)〔5〕制作全腦缺血再灌注模型。動物常規(guī)麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，并分別置線標(biāo)記備用。其后將大鼠枕后部正中切開，暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼孔，熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間2～4 s，將翼小孔后雙側(cè)椎動脈永久閉塞。常規(guī)消毒縫合傷口，單獨放回籠中，造模后24 h，在大鼠清醒狀態(tài)下夾閉兩側(cè)的頸動脈20 min，實行再灌注，最后完成縫合。CIP組大鼠首先同CIR組大鼠采用改良的Pulsinelli 4-VO制作大鼠全腦缺血模型，實現(xiàn)永久再灌注之前，進(jìn)行松開動脈夾15 s，再夾閉15 s，如此進(jìn)行3次缺血/再灌注循環(huán)，實現(xiàn)CIP。Sham組分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。缺血再灌注后6、24、48、72 h進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色免疫組化染色及Western印跡檢測。

1.4 水迷宮檢測 Morris水迷宮是檢測空間學(xué)習(xí)記憶功能的一種常用方法。需要對大鼠進(jìn)行訓(xùn)練，每日2～3次，連續(xù)3 d，每次訓(xùn)練將大鼠面向池壁依次從4個象限的固定入水點放入水中，訓(xùn)練其通過空間標(biāo)志物尋找平臺的能力。正式試驗時往水池內(nèi)注水使平臺藏于水面下方，再從某一個象限放大鼠進(jìn)水池。電腦追蹤記錄大鼠從入水到登上站臺所需要的時間(潛伏期)和穿過平臺的次數(shù)以觀察其對平臺的記憶。設(shè)定1次游泳時間90 s，如果大鼠超過這個時間沒有找到隱藏在水下的平臺，將其引導(dǎo)至站臺，熟悉30 s。根據(jù)計算機(jī)的記錄儀記錄大鼠游泳的軌跡、逃避潛伏期及穿臺次數(shù)，并求各組均值。

1.5 HE染色 各組各時間點4只大鼠，規(guī)定時間以0.4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，4℃冰箱放置至少24 h。在視交叉后1～6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，每只動物取5張海馬區(qū)切片，片厚4 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色。選用Motic-6.0圖像采集及分析系統(tǒng)來計算每個視野的存活的神經(jīng)元數(shù)，以平均細(xì)胞存活密度(存活細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值)表示。

1.6 免疫組化染色 常規(guī)麻醉動物，開胸用4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1和6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。切片常規(guī)脫蠟至水，然后滴加一抗(CyclinD:1 ∶200;CDK4:1 ∶200)，濕盒中 4℃過夜，滴加二抗，37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡(10×40倍)下觀察并計數(shù)組織中陽性細(xì)胞數(shù)，每個標(biāo)本取5張切片，每個切片隨機(jī)選取不重復(fù)的視野3～5個，計數(shù)各個視野下的陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.7 Western印跡檢測 處死大鼠后，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，加入單去污劑裂解液(含PMSF)提取蛋白，4℃、12 000 r/min離心15min取上清。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液0.8 ml和BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)混合配制成濃度為25 mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。根據(jù)電腦繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測蛋白的濃度。100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液中封閉至少1 h，加入 CyclinD1、CDK4(1∶500)與actin(1∶1 000)的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶800)，37℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件分析各因子的平均灰度值，將目的因子和內(nèi)參的平均灰度值的比值進(jìn)行比較。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組水迷宮檢測結(jié)果 與Sham組比較，CIR組在72 h的逃避潛伏期時間明顯延長、穿臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應(yīng)時間點的潛伏期明顯縮短、穿臺次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 各組水迷宮潛伏期和穿臺次數(shù)比較(，n=12)

表1 各組水迷宮潛伏期和穿臺次數(shù)比較(，n=12)

與Sham組比較:1)P＜0.05;與CIR組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 潛伏期(s) 穿臺次數(shù)(次)Sham 組 20.02±0.24 12.87±1.30 CIR 組 62.03±1.421) 2.97±1.261)CIP 組 45.96±1.461)2) 6.59±0.671)2)

圖1 水迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能

2.2 各組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 Sham組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完好、胞質(zhì)淡染而均勻;CIR組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核有明顯的固縮、碎裂征象，間質(zhì)水腫，與Sham組比較，CIR組各時間點神經(jīng)細(xì)胞存活率顯著降低(P＜0.05);CIP組各時間點神經(jīng)元形態(tài)損傷程度減輕，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核變性減輕，與CIR組比較，CIP組在各時間點存活神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量增多(P＜0.05)。見表 2，圖 2。

2.3 各組海馬區(qū)CyclinD1免疫組化和Western印跡結(jié)果 免疫組化結(jié)果:CyclinD1陽性產(chǎn)物呈棕黃色染色，表達(dá)在細(xì)胞核中，Sham組偶見陽性細(xì)胞，CIR、CIP組有不同程度的陽性產(chǎn)物表達(dá)量，且隨時間陽性細(xì)胞逐漸增多，72 h達(dá)高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CyclinD1的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應(yīng)時間點 CyclinD1陽性細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P＜0.05)。見圖3，表3。

表2 各組海馬區(qū)神經(jīng)元存活率比較(，%，n=12)

表2 各組海馬區(qū)神經(jīng)元存活率比較(，%，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 98.41±1.00 98.10±1.22 97.60±1.48 97.59±1.47 CIR 組 76.25±1.131)69.14±1.631)61.99±1.611)54.19±1.751)CIP 組 87.06±0.911)2)79.63±1.531)2)70.10±1.681)2)63.98±1.361)2)

圖2 各組24 h海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(HE，×400)

圖3 各組24 h海馬區(qū)CyclinD1免疫組化染色結(jié)果(DAB，×400)

表3 各組海馬區(qū)CyclinD1陽性細(xì)胞數(shù)比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

表3 各組海馬區(qū)CyclinD1陽性細(xì)胞數(shù)比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 3.24±1.28 3.17±0.99 3.31±1.24 3.30±1.18 CIR 組 11.06±0.701)15.55±0.861)22.23±1.071)29.66±1.191)CIP 組 7.03±1.211)2)11.15±1.071)2)17.35±0.931)2)25.09±0.881)2)

Western印跡分析結(jié)果:Sham組CyclinD1蛋白表達(dá)量較低，而CIR、CIP組隨時間延長表達(dá)量逐漸增加，72 h達(dá)高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CyclinD1蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組在相應(yīng)時間點CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。見表 4，圖 4。

表4 各組海馬區(qū)CyclinD1蛋白水平比較(，n=12)

表4 各組海馬區(qū)CyclinD1蛋白水平比較(，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 0.26±0.04 0.27±0.05 0.26±0.07 0.27±0.06 CIR 組 0.58±0.061) 0.75±0.091) 0.84±0.081) 0.89±0.091)CIP 組 0.35±0.081)2)0.43±0.091)2)0.56±0.061)2)0.63±0.071)2)

2.4 各組海馬區(qū)CDK4免疫組化和Western印跡結(jié)果

免疫組化結(jié)果:CDK4陽性產(chǎn)物表達(dá)在細(xì)胞核中，呈棕黃色染色，Sham組偶見陽性細(xì)胞，CIR、CIP組有不同程度的陽性產(chǎn)物表達(dá)量，且隨時間延長陽性細(xì)胞逐漸增多，72 h達(dá)高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CDK4陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應(yīng)時間點CDK4陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低(P＜0.05)。見表 5，圖 5。

圖4 Western印跡檢測各組基底動脈CyclinD1的表達(dá)

Western印跡分析結(jié)果:Sham組CDK4蛋白量較少，而CIR、CIP組隨時間延長表達(dá)量逐漸增加，72 h達(dá)高峰。與sham組比較，CIR組在各時間點CDK4蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應(yīng)時間點CDK4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。見表 6，圖 6。

表5 各組大鼠海馬區(qū)CDK4陽性細(xì)胞數(shù)比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

表5 各組大鼠海馬區(qū)CDK4陽性細(xì)胞數(shù)比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 3.30±0.73 3.25±1.41 3.40±1.76 3.45±1.57 CIR 組 10.10±1.551)16.45±1.261)23.60±1.311)29.60±2.081)CIP 組 5.80±1.421)2)11.40±1.351)2)19.25±1.031)2)25.45±1.251)2)

圖5 各組24 h海馬區(qū)CDK4免疫組化染色結(jié)果(DAB，×400)

表6 各組大鼠海馬區(qū)CDK4蛋白水平比較(，n=12)

表6 各組大鼠海馬區(qū)CDK4蛋白水平比較(，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 0.20±0.04 0.23±0.03 0.22±0.04 0.22±0.06 CIR 組 0.50±0.091) 0.65±0.051) 0.73±0.071) 0.86±0.091)CIP 組 0.29±0.071)2)0.38±0.061)2)0.42±0.091)2)0.51±0.081)2)

圖6 Western印跡檢測各組基底動脈CDK4的表達(dá)

3 討論

CIP指在再灌注開始時對阻塞的血管進(jìn)行短暫、重復(fù)的開通及再閉，隨后恢復(fù)血管血流的再通。CIP在心血管領(lǐng)域的研究已表明可以減少缺損面積，并已嘗試將其應(yīng)用于臨床工作〔6〕。CIP的作用隨著研究的不斷深入在不同動物的肺、腎、肝等均得到證實〔7～9〕。2006年Zhao等〔10〕發(fā)現(xiàn)CIP具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)腦功能的作用。本研究結(jié)果說明CIP對缺血性腦卒中起到了良好的保護(hù)作用。CIP作為一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，腦保護(hù)作用機(jī)制廣泛而復(fù)雜，對其機(jī)制研究已在多個水平上進(jìn)行了相當(dāng)多的工作，已發(fā)現(xiàn)CIP與避免氧自由基的過度產(chǎn)生、線粒體鈣超載、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路等有關(guān)〔11～13〕。但是否還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損的海馬組織尚不清楚。

細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期、M期。細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育有賴于細(xì)胞周期的正常運行，細(xì)胞周期是細(xì)胞分化與增殖的內(nèi)在組分。細(xì)胞周期的進(jìn)程主要是通過Cyclins和CDKs的調(diào)控而實現(xiàn)〔14〕。Cyclins在腦缺血中均有異常表達(dá)，而CDK4在腦缺血損傷中具有重要作用，抑制它的活性具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。Trimsit等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后半暗帶神經(jīng)元內(nèi) CyclinD1和CDK4的表達(dá)是評估缺血神經(jīng)元是否再次進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵標(biāo)志。目前認(rèn)為，CyclinD1/CDK4主要參與以非興奮性毒性為主的缺血/缺氧引起的神經(jīng)死亡過程。CyclinD是聯(lián)系細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞周期的紐帶。CDK具有催化底物磷酸化的活性，其主要作用是調(diào)控細(xì)胞周期的不同時相，從G1、S、G2到M期，完成循環(huán)。Katchanov等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注大鼠模型中，內(nèi)源性CDKI p16INK4a的缺失可導(dǎo)致紋狀體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡;表明細(xì)胞周期與神經(jīng)元損傷之間存在聯(lián)系。本研究結(jié)果說明CIP可能是通過降低全腦缺血大鼠海馬區(qū)CyclinD1、CDK4的表達(dá)從而起到調(diào)控細(xì)胞周期而保護(hù)神經(jīng)元的作用。缺血性腦卒中后細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂，與產(chǎn)生大量氧自由基、出現(xiàn)氧化應(yīng)激有關(guān)。劉靜〔16〕對人胃黏膜細(xì)胞(GES)-1細(xì)胞加用抗氧化劑后，細(xì)胞內(nèi)活性氧減少，氧化應(yīng)激降低同時緩解了細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。而缺血后處理的重要保護(hù)機(jī)制抑制即為氧自由基的堆積，維持活性氧清除系統(tǒng)的平衡〔17〕。本研究結(jié)果提示，CIP可能是通過抑制氧化應(yīng)激而下調(diào)細(xì)胞周期因子CyclinD1和CDK4蛋白的表達(dá)，從而實現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控。

綜上，CIP在腦缺血再灌注損傷后加速神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)的機(jī)制可能與影響Cyclin及CDKs的表達(dá)有關(guān)，從促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展進(jìn)而加快神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)的途徑切入，為腦缺血再灌注損傷的防治提供新思路。