蘇 薇 吳會(huì)超 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

胃癌發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。胃泌素是胃腸道細(xì)胞分泌的胃腸激素，研究證實(shí)胃泌素在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色〔1〕。目前關(guān)于胃泌素的作用機(jī)制尚未闡明，基因調(diào)控、家族途徑等為其主要作用途徑，可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，刺激癌細(xì)胞增殖分化。骨橋蛋白(OPN)為磷酸化糖蛋白，其與致癌潛能相關(guān)，可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，如促進(jìn)細(xì)胞的浸潤(rùn)、黏附、抑制凋亡及促進(jìn)血管的形成等〔2，3〕。本文分析胃泌素及其受體拮抗劑對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN-45中OPN表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞MKN45由上?；鄯f生物科技有限公司提供;丙谷胺購(gòu)自江蘇亞邦?lèi)?ài)普森藥業(yè)有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自上海信裕生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司;胃泌素與OPN試劑盒購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司;新生小牛血清購(gòu)自北京諾亞杰生物科技有限公司;放射免疫檢測(cè)儀購(gòu)自瑞萊生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)溫度＜37℃，在 RP-MI1640培養(yǎng)基中加入10%小牛血清，進(jìn)行人胃癌細(xì)胞MKN45的培養(yǎng)，3 d傳代1次，利于細(xì)胞貼壁良好生長(zhǎng)。取細(xì)胞貼壁后72 h細(xì)胞，通過(guò)0.25%胰蛋白酶處理，制成5×107個(gè)/L的細(xì)胞懸液。

1.2.2 人胃癌細(xì)胞MKN45增殖檢測(cè) MKN45胃癌細(xì)胞經(jīng)0.125%胰蛋白酶處理，在RPMI1640培養(yǎng)基稀釋后，制成5×107個(gè)/L的細(xì)胞懸液。接種環(huán)境溫度＜37℃，接種于96孔板，培養(yǎng)箱條件為:5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為 3組，胃泌素組:胃泌素10－6mol/L;聯(lián)合組:胃泌素(10－6mol/L)+丙谷胺(10－2mol/L);對(duì)照組:培養(yǎng)液中不添加丙谷胺。培養(yǎng)完成后，MTT法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞MKN45增殖情況。用二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。每孔加MTT溶液〔5 mg/ml用磷酸鹽緩沖液(PBS)配〕20 μl繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(OD值)，持續(xù)3次。促細(xì)胞增殖率(PR)=(OD實(shí)驗(yàn)組值－OD對(duì)照組值)/OD實(shí)驗(yàn)組值×100%，PR值為正，表明藥物對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用;PR值為負(fù)，表明藥物對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用;PR為0，表明對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。

1.2.3 OPN蛋白檢測(cè) 于24孔板上，加入細(xì)胞數(shù)量為5×107個(gè)/L的細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后分組并加藥。12、24、36 h加入抑肽酶，每孔1 500 U，收集培養(yǎng)上清液，采用1∶10細(xì)胞裂解液裂解胃癌細(xì)胞，與培養(yǎng)上清液3 000 r/min離心15 min，獲得上清液，保存在－80℃下待測(cè)，最后嚴(yán)格按照放射免試劑盒操作要求，收集上清液中OPN含量，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MKN45中OPN蛋白的表達(dá)及胃泌素和丙谷胺對(duì)其表達(dá)的影響。其次，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RTPCR)檢測(cè)胃癌細(xì)胞株MKN45中OPN蛋白的表達(dá)及胃泌素和丙谷胺對(duì)其表達(dá)的影響，首先提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的濃度;其次，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再次，進(jìn)行瓊脂糖電泳以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的均一性。將配好的3%瓊脂糖電泳液灌注制膠板凝固后，上樣。低壓電泳儀100 V，55 mA約60 min跑膠。紫外分析儀上觀察結(jié)果。采用BIO-RAD軟件計(jì)算出目的基因與內(nèi)參的比值，OPN mRNA表達(dá)量以O(shè)PN與內(nèi)參的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖情況 胃泌素組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖OD值明顯高于對(duì)照組、聯(lián)合組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值明顯升高。聯(lián)合組中丙谷胺對(duì)人胃癌細(xì)胞MKN45增殖具有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用明顯增加。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖情況()

表1 各組人胃癌細(xì)胞MKN45增殖情況()

與胃泌素組比較:1)P＜0.05

組別 24 h 48 h OD值 PR(%)OD值 PR(%)聯(lián)合組 0.54±0.051) － 0.77±0.061) －胃泌素組 0.61±0.04 +11.48 0.96±0.05 +19.79對(duì)照組 0.56±0.021) －8.93 0.79±0.081) －21.52

圖1 各組胃癌細(xì)胞增殖情況(SP，×400)

2.2 各組OPN表達(dá)情況 OPN出現(xiàn)在人胃癌細(xì)胞MKN45培養(yǎng)液中，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，OPN表達(dá)明顯增高，胃泌素組OPN水平明顯高于對(duì)照組和聯(lián)合組，聯(lián)合組明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組OPN水平比較()

表2 各組OPN水平比較()

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與胃泌素組比較:2)P＜0.05

組別 12 h 24 h 36 h聯(lián)合組 0.67±0.231)2) 0.78±0.241)2) 0.91±0.121)2)胃泌素組 0.97±0.181) 1.25±0.171) 1.67±0.261)對(duì)照組 0.71±0.12 0.98±0.11 1.19±0.20

圖2 OPN、β-actin PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

胃癌是消化內(nèi)科常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率相對(duì)較高。胃癌發(fā)生原因復(fù)雜，與飲食、環(huán)境、基因、細(xì)菌感染等因素有關(guān)，早期癥狀不明顯，就診時(shí)已發(fā)展到中晚期。流行病學(xué)調(diào)查顯示，胃癌患者治療后復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，累及周?chē)K器，導(dǎo)致多臟器衰竭，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)〔4～6〕。在胃癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞因子、信號(hào)通路等參與其中。隨著臨床對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)人胃癌細(xì)胞MKN45增殖、OPN、胃泌素在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中占據(jù)重要地位。多數(shù)研究表明，胃泌素的促癌作用臨床已證實(shí)〔7～9〕。胃泌素由胃腸道細(xì)胞分泌，其作用機(jī)制為刺激癌細(xì)胞增殖。胃泌素主要通過(guò)基因、家族等途徑作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。有研究表明，胃泌素 10－6～10－9mol/L時(shí)，具有促進(jìn)MKN45細(xì)胞增殖的作用，與丙谷胺聯(lián)合時(shí)，該促進(jìn)作用被阻斷，提示胃泌素經(jīng)受體介導(dǎo)刺激體外培養(yǎng)胃癌增殖〔10，11〕。早期有文獻(xiàn)報(bào)道，胃泌素可促進(jìn)十二指腸旁黏膜表皮生長(zhǎng)因子(EGF)分泌，表明胃泌素通過(guò)EGF刺激胃黏膜增殖〔12〕。

OPN是一種磷酸化糖蛋白，具有非膠原性和分泌性〔13〕。OPN在不同動(dòng)物各種組織中均有表達(dá)，正常情況下OPN幾乎不表達(dá)或表達(dá)甚微，但在一些誘導(dǎo)因素下大量表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤惡化，可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。有研究表明，檢測(cè)胃癌組織中OPN表達(dá)，其表達(dá)率高達(dá)100%，72%以上胃癌組織或淋巴轉(zhuǎn)移灶中OPN呈高表達(dá)狀態(tài)，提示OPN蛋白和胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。OPN主要參與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用，可能機(jī)制為〔14〕:(1)通過(guò)受體整合素 α、β5發(fā)揮作用;(2)與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子發(fā)揮協(xié)同作用;(3)與表面CD44結(jié)合發(fā)揮作用;(4)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子發(fā)揮協(xié)同作用;(5)通過(guò)自分泌及旁分泌發(fā)揮途徑;(6)抑制NO、O2、OH－等產(chǎn)生促進(jìn)轉(zhuǎn)移細(xì)胞生存。有研究表明〔15〕，OPN蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，推測(cè)參與了乳腺癌鈣化過(guò)程。有研究表明，胃泌素可促進(jìn)OPN表達(dá)，并促進(jìn)人胃癌細(xì)胞MKN45增殖〔16〕。

本研究結(jié)果提示胃泌素可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN45增殖和OPN表達(dá)，且丙谷胺起到了拮抗作用。胃癌細(xì)胞MKN45產(chǎn)生過(guò)程中，分泌出胃泌素，采用丙谷胺可抑制胃泌素的分泌，一旦分泌胃泌素，胃泌素受體又在細(xì)胞表面表達(dá)，可見(jiàn)丙谷胺可抑制胃泌素的分泌。有文獻(xiàn)報(bào)道〔17〕，17肽胃泌素在1～1 000 nmol/L時(shí)可促進(jìn)MKN45細(xì)胞增殖，聯(lián)合丙谷胺時(shí)，阻斷了這種促進(jìn)作用。丙谷胺是臨床治療消化性潰瘍的常見(jiàn)藥物，具有抗胃泌素的作用，有利于控制胃酸，抑制胃蛋白酶分泌，促進(jìn)胃黏膜愈合。胃泌素作用于癌細(xì)胞的途徑廣泛，如神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、自分泌等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，故及時(shí)阻斷胃泌素對(duì)腫瘤細(xì)胞的刺激十分重要。在胃癌治療過(guò)程中，丙谷胺治療效果雖無(wú)法與放療、化療比擬，但其可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化，為胃癌治療指明新的方向〔18〕。

綜上，胃癌細(xì)胞MKN45中存在OPN表達(dá)，胃泌素可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN45增殖、OPN表達(dá)，聯(lián)合胃泌素受體拮抗劑后，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和OPN表達(dá)。