初 旭 高 輝 金 光 王 井 劉易軍 王 菁 單玉興(吉林大學(xué)第一醫(yī)院分院骨科，吉林 長春 130021)

通常股骨頭壞死按病因分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性，具體發(fā)病過程為股骨頭血供受阻或中斷導(dǎo)致股骨頭漸進(jìn)性塌陷，引起患者關(guān)節(jié)疼痛，活動受限〔1〕。老年患者因為其特殊性，成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死(NONFH)的高發(fā)人群。該病早期沒有明顯的臨床癥狀，后期只能通過人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)來緩解癥狀和功能。目前，老年NONFH患者發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但是T細(xì)胞和B細(xì)胞的作用是公認(rèn)的致病因素〔2，3〕。針對股骨頭壞死的T細(xì)胞免疫作用研究的較多，而B細(xì)胞的作用研究較少。本研究通過對比老年NONFH患者外周血中記憶B細(xì)胞亞群、漿母細(xì)胞亞群及血清免疫球蛋白(Ig)的變化來探究B細(xì)胞亞群在該病發(fā)病過程中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 吉林大學(xué)第一醫(yī)院門診和住院部收治的28例老年無菌性NONFH病人為NONFH組。其中男18例，女10例，平均年齡62(64～78)歲:10名無任何慢性疾病史的健康人為健康對照(HC)組，其中男8名，女2名，平均年齡64(62～74)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。NONFH組疾病分級參照股骨頭壞死四期分類(FICAT)分期標(biāo)準(zhǔn)〔4〕，股骨頭塌陷指數(shù)依照朱建辛等〔5〕提出的標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分。排除有創(chuàng)傷性股骨頭壞死、骨腫瘤、強(qiáng)直性脊柱炎、髖關(guān)節(jié)先天發(fā)育不良、髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性疾病及近期感染者。本研究經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，均獲得患者的同意。

1.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測外周血單核細(xì)胞(PBMC) 通過密度梯度分離獲得單個PBMC。使用APC-H7-anti-CD3、PerCP-Cy5.5-anti-CD19、PECy7-anti-CD27、APC-anti-CD38、PE-anti-CD138、PE-CF594-anti-CD20、FITC-anti-IgD(購自美國BD Biosciences)避光染色30 min。在清洗后，使用專用的固定破膜液進(jìn)行固定和破膜。之后通過bv510-抗IgG和bv421-抗IgM細(xì)胞內(nèi)染色。用同類型匹配的方法對其同型組進(jìn)行染色。通過Flowjo7.6軟件分析結(jié)果。

1.3 Ig測定 血清總IgG、IgM、IgA濃度根據(jù)微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗、Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血中記憶B細(xì)胞變化 與HC組比較，NONFH組外周血中 IgD+CD27－B 細(xì)胞、IgD－CD27－B細(xì)胞數(shù)量顯著升高(均P＜0.001)，而IgD+CD27+B細(xì)胞、IgG+IgD-CD27+B細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.001，P=0.006)。而IgD－CD27+B細(xì)胞、IgM+IgD-CD27+B細(xì)胞在兩組間沒有明顯差異(P＞0.05)，見圖1，表1。

2.2 兩組外周血中漿母細(xì)胞變化 NONFH組漿母細(xì)胞、CD38+、CD38+CD138+、CD38+IgM+、CD38+IgG+漿母細(xì)胞數(shù)量顯著高于 HC組(P＜0.001)。見圖 2、表2。

圖1 記憶B細(xì)胞亞群劃分

表1 兩組記憶B細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)量(，106/L)

表1 兩組記憶B細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)量(，106/L)

組別 n IgD+CD27－B細(xì)胞IgDCD27 B細(xì)胞IgDCD27 B細(xì)胞IgDCD27 B細(xì)胞IgGIgDCD27+B細(xì)胞IgM+IgD－CD27+B細(xì)胞－+++－－+－NONFH 組 28 84．6±37．5 49．3±21．2 28．9±14．1 18．91±6．23 10．25±6．53 6．23±5．20 HC 組 10 39．0±9．5 42．5±27．4 62．1±29．3 5．69±4．49 24．51±13．38 5．92±2．08 P 值 ＜0．001 ＞0．05 ＜0．001 ＜0．001 0．006 ＞0．05

圖2 漿母細(xì)胞亞群劃分

表2 兩組漿母細(xì)胞及其亞群細(xì)胞數(shù)量(，×106/L)

表2 兩組漿母細(xì)胞及其亞群細(xì)胞數(shù)量(，×106/L)

組別 n 漿母細(xì)胞 CD38+漿母細(xì)胞 CD38+CD138+漿母細(xì)胞 CD38+IgG+漿母細(xì)胞 CD38+IgM+漿母細(xì)胞NONFH 組 28 18．56±14．52 16．25±14．51 7．25±5．33 5．15±4．65 9．67±10．38 HC 組 10 5．06±2．48 4．90±1．68 1．03±0．69 0．26±0．41 3．65±1．49 P 值 ＜0．001 ＜0．001 ＜0．001 ＜0．001 ＜0．001

2.3 兩組外周血中Ig水平 IgM和IgA在兩組中無明顯變化(P＞0.05)，NONFH組中IgG水平明顯高于HC組(P＜0.001)。見表3。NONFH組中 IgG+IgDCD27+B細(xì)胞數(shù)量與IgG濃度、CD138+CD38+漿母細(xì)胞、IgG+CD38+漿細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(r=－0.446，P=0.034;r=－0.556，P=0.013;r= －0.482，P=0.022)，IgG與CD38+CD138+漿母細(xì)胞和IgG+CD38+漿母細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.562，P=0.015;r=0.479，P=0.026)。見圖3。

表3 兩組IgG、IgM、IgA含量(，g/L)

表3 兩組IgG、IgM、IgA含量(，g/L)

組別 n IgG IgM IgA NONFH 組 28 50．64±21．10 2．16±1．25 4．53±2．21 HC 組 10 18．26±5．25 2．02±1．43 6．14±1．62 P 值 ＜0．001 ＞0．05 ＞0．05

圖3 NONFH組外周血中B細(xì)胞亞群與IgG、漿母細(xì)胞亞群相關(guān)性

3 討論

NONFH是骨科上常見的慢性疾病，致病因素較多且發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究表明免疫失衡在NONFH的病理過程中起到了重要作用〔6，7〕。有研究證明記憶B細(xì)胞會在活化的B細(xì)胞刺激下分化成漿母細(xì)胞〔8〕。記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞表達(dá)頻率失衡與很多慢性炎性疾病的發(fā)生都有關(guān)系〔9～13〕，同時，輔助性 T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)也被證實參與NONFH的病理過程中〔13〕。本研究與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致〔14〕，記憶 B細(xì)胞在二次免疫應(yīng)答時，可快速作用于抗原，轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞并分泌免疫球蛋白。但是，在本研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞與患者臨床分期的聯(lián)系。本研究表明，NONFH的炎癥過程的確某種程度上刺激了記憶B細(xì)胞和漿母細(xì)胞的增長。