吳 慧 鄭根建 何 龍 陶 巍 肖 旭 (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科，海南 ?？?57023)

口腔癌是世界第六大常見腫瘤，據(jù)報道口腔癌每年新發(fā)病例26.3萬例，死亡近13萬〔1，2〕。我國每年新發(fā)口腔癌病例近4.65萬例〔2〕。目前口腔癌發(fā)病原因尚不是十分明確，相關(guān)研究表明吸煙、飲酒、口腔衛(wèi)生差、膳食類型等因素與口腔癌有關(guān)，其中多數(shù)老年患者由于不良生活習(xí)慣，長期吸煙及飲酒導(dǎo)致多種基礎(chǔ)疾病，使口腔癌發(fā)病的影響更加復(fù)雜〔3～5〕。本研究通過檢測老年口腔癌組織及外周血中白細胞介素(IL)-6和叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子(Foxp)3的表達，探討其發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年3月至2017年3月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科門診治療并經(jīng)病理分析確診的60例原發(fā)性口腔癌患者為觀察組，術(shù)前均未進行過任何的抗腫瘤治療，并同時選取50例口腔良性腫瘤患者為對照組。年齡60～78歲，平均(69.8±5.1)歲，兩組平均年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);其中觀察組發(fā)病部位包括舌、牙齦、頰黏膜及口底等，對照組男27例，女23例，兩組性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 樣本的收集 于清晨空腹抽取患者外周靜脈血3 ml，用于流式細胞術(shù)檢測。兩組手術(shù)切除新鮮標本予以固定脫水、石蠟包埋，每例組織進行連續(xù)4張切片，切片厚度約為4 μm，并將切片置于預(yù)處理的載玻片上，60℃烘箱中放置過夜，以備免疫組織化學(xué)染色檢測IL-6和Foxp3的表達。

1.3 外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測外周血IL-6濃度。IL-6單抗包被于酶標板上，血清中的 IL-6與單抗結(jié)合;加入生物素標記IL-6二抗，在酶標板上形成抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物;加入顯色液進行顯色處理;用酶標儀測量吸光度值，繪制標準曲線計算血漿中IL-6濃度。步驟如下:濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋，混勻后備用;將標準品進行稀釋，并得到200 pg/ml的高濃度標準品，然后依次稀釋為:100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13，0.00 pg/ml;在酶標板上加入 100 μl標準品及待測樣品，每個樣品加一個孔;混勻后封住板孔，室溫孵育2 h;去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入100 μl IL-6抗體生物素液，混勻后室溫孵育1 h;去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入 100 μl酶聯(lián)結(jié)合液，混勻后室溫孵育30 min;去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次;每孔加入 100 μl顯色液，混勻后室溫孵育30 min;反應(yīng)完成后，在每孔中加入 50 μl終止液，混勻，在酶標儀上讀取吸光度值;繪制標準曲線;將待測樣本的吸光度帶入標準曲線對應(yīng)的方程中，計算待測樣本的濃度。外周血中Foxp3的檢測步驟同上。

1.4 組織切片中IL-6，F(xiàn)oxp3的檢測 將組織切片至于68℃烤箱30 min，再行脫蠟處理，梯度酒精脫水:二甲苯孵育5 min，加入新的二甲苯繼續(xù)孵育5 min，無水乙醇洗滌3 min，95%乙醇洗滌3 min，80%乙醇洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min;以檸檬酸鈉為修復(fù)液進行熱修復(fù)，將載有玻片的盒子置入高壓鍋內(nèi)電磁爐加熱至沸騰煮5 min后，停止加熱，并冷卻至室溫;甲醇-H2O2溶液予以避光修復(fù)20 min，PBS洗滌3次，每次3 min;按照1∶500的比例加入IL-6抗體，對石蠟組織切片進行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用1×PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;按照 1∶1 000的比例加入辣根過氧化物酶(HRP)二抗，對石蠟組織切片進行室溫孵育40 min，之后用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒中的顯色劑，室溫孵育 5～10 min，然后清水沖洗;再進行蘇木精復(fù)染室溫孵育3～5 min，清水沖洗;對染色后的切片進行梯度酒精水化處理，然后樹膠封片觀察。采用上述同樣的操作方法，對組織切片中的Foxp3進行免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.5 結(jié)果的判定 Foxp3表達陽性的細胞，通過免疫組織化學(xué)染色，細胞核內(nèi)有棕黃色顆粒;IL-6表達的陽性細胞，細胞質(zhì)或細胞膜內(nèi)可觀察到棕色顆粒。以PBS代替一抗，進行正常人群口腔黏膜上皮組織的免疫組織化學(xué)染色為實驗的陰性對照組，以ELISA試劑盒中的陽性染色結(jié)果，作為實驗的陽性對照組。在400×的視野下，隨機選取5個視野，并對這5個視野中的細胞總數(shù)以及陽性細胞進行計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行t、χ2檢驗，相關(guān)性檢驗采用Spearman分析。

2 結(jié)果

2.1 外周血中IL-6、Foxp3表達水平的比較 觀察組外周血中IL-6平均濃度顯著高于對照組(P＜0.05);Foxp3在對照組外周血中平均濃度顯著低于觀察組(P＜0.05)，見表 1。

2.2 多水平檢測口腔癌患者外周血中IL-6、Foxp3的表達 IL-6濃度在男性和女性患者及有無吸煙史者表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);不同的TNM分期階段，IL-6濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032)，F(xiàn)oxp3濃度在男性和女性患者中有無吸煙史的患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Ⅲ/Ⅳ期患者Foxp3濃度顯著高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P=0.001)，見表2。

表1 兩組外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3濃度比較(，μg/L)

表1 兩組外周血中IL-6，F(xiàn)oxp3濃度比較(，μg/L)

組別 n IL-6 Foxp3對照組 50 1.72±0.28 23.78±3.56觀察組 60 4.83±1.37 41.22±4.17 t值P值15.67＜0.05 23.32＜0.05

表2 多水平比較口腔癌患者外周血、口腔組織中IL-6、Foxp3的表達(，μg/L)

表2 多水平比較口腔癌患者外周血、口腔組織中IL-6、Foxp3的表達(，μg/L)

因素 n 外周血口腔組織(n)IL-6 P值 Foxp3 P值IL-6表達 P值 Foxp3表達 P值性別 男 33 4.79±1.32 0.871 40.37±3.98 0.103 17 0.262 17 0.755 27 4.85±1.53 42.13±4.23 10 15吸煙史 有 38 4.85±1.42 0.635 41.89±4.27 0.412 19 0.306 19 0.496無 22 4.67±1.38 40.97±3.94 8 13 TNM 分期 Ⅰ/Ⅱ 39 4.52±1.51 0.032 39.26±3.86 0.001 12 0.003 17 0.039Ⅲ/Ⅳ 21 5.37±1.27 43.17±4.31 15 15女

2.3 口腔癌患者外周血中IL-6與Foxp3的相關(guān)性口腔癌患者外周血中IL-6表達平均水平為(4.83±1.37)μg/L，F(xiàn)oxp3表達平均水平為(41.22±4.17)μg/L，兩者表達呈正相關(guān)(r=0.40，P＜0.05)，見圖1。

2.4 各組口腔組織中IL-6，F(xiàn)oxp3表達陽性率比較IL-6陽性表達率兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);Foxp3在兩組中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表 3、圖 2。

圖1 口腔癌患者中IL-6與Foxp3呈正相關(guān)

表3 兩組口腔組織中IL-6，F(xiàn)oxp3表達陽性率比較〔n(%)〕

圖2 兩組口腔組織中IL-6、Foxp3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(DAB，400×)

2.5 多水平檢測口腔癌患者癌組織中IL-6，F(xiàn)oxp3的表達 在口腔癌患者組織中IL-6、Foxp3陽性表達率在男性和女性患者中、有吸煙和無吸煙的患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);不同TNM分期階段，IL-6、Foxp3的陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.6 口腔癌患者癌組織中IL-6與Foxp3的相關(guān)性IL-6與Foxp3陽性表達呈正相關(guān)(r=0.38，P＜0.05)。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是最常見的口腔惡性腫瘤，其惡性程度高、進展快、預(yù)后效果較差，易侵犯周圍鄰近組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，預(yù)后較差〔6，7〕。由于早期癥狀不很明顯，導(dǎo)致許多患者在就診時已經(jīng)處于中晚期，并且發(fā)病也主要發(fā)生于40歲以上的中老年人〔7〕。老年口腔癌患者其主要表現(xiàn)在諸多老年患者飲酒、吸煙等不良口腔生活習(xí)慣較久，暴露于煙草、酒精等其他危險因素的時間也較長，與年輕口腔癌患者相比其發(fā)病因素也更復(fù)雜〔3，4〕。研究指出，對口腔癌患者進行早診斷早治療，可有效改善其預(yù)后〔7〕。在癌癥中尋找相關(guān)特異性的蛋白標志物及相關(guān)生化指標，尤其在口腔癌患者組織或血清中尋求腫瘤標志物對口腔癌的早診斷治療及對患者預(yù)后具有重要的臨床應(yīng)用價值〔8～10〕。

IL-6是一種多功能細胞因子，在機體參與腫瘤免疫過程中具有影響腫瘤細胞增殖、分化的作用〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清IL-6水平顯著增高，且與患者預(yù)后具有相關(guān)性，提示IL-6水平異?；蛟S會引起膽管上皮的增殖改變，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔8〕。Wei等〔9〕發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中 IL-6的表達明顯增高，提示腫瘤細胞產(chǎn)生的IL-6可能作用于宿主并參與腫瘤血管的形成，改變組織局部的免疫機制，引發(fā)腫瘤細胞進一步增殖、分化〔9〕。本研究與先前國外學(xué)者研究結(jié)果一致，暗示著口腔癌組織中合成分泌IL-6的能力增強與口腔癌的發(fā)生密切相關(guān)〔10〕。

Foxp3在Treg細胞的發(fā)育及調(diào)控中起重要作用，F(xiàn)oxp3分子通過發(fā)揮強烈的抑制抗腫瘤免疫功能，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生，視為判斷腫瘤患者生存期和預(yù)后的一個重要指標〔12～14〕。研究表明，F(xiàn)oxp3基因沉默的細胞株具有顯著減弱 T細胞增殖的抑制作用，提示Foxp3可通過某種作用機制來影響效應(yīng)性T細胞免疫功能〔12〕;研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3基因表達具有明顯降低沉默癌細胞中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IL-10表達，表明腫瘤細胞中 Foxp3可能通過影響VEGF及IL-10的表達，參與血管形成及免疫抑制來促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展〔15〕。B細胞經(jīng)由Th2細胞產(chǎn)生的IL-6促進分化分泌免疫球蛋白(Ig)A，從而顯著影響T細胞增殖與分化〔12〕。在腫瘤微環(huán)境下，異常表達的IL-6導(dǎo)致體液免疫調(diào)節(jié)紊亂，進而導(dǎo)致機體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)異?！?1〕。細胞毒性T細胞的終末因子IL-6會進一步導(dǎo)致T細胞的增殖與分化發(fā)生異常，從而加重對機體的毒性〔14，15〕。腫瘤細胞產(chǎn)生IL-6引發(fā)口腔黏膜局部周圍組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞甚至重構(gòu)，促進Foxp3的表達，抑制體內(nèi)T細胞免疫功能的發(fā)揮，從而導(dǎo)致腫瘤進一步發(fā)展。