張進(jìn)忠，石 科,2，郭 丹，楊 亮，閆秀明

1．河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物化學(xué)教研室，河南 鄭州 451191；

2．鄭州大學(xué)細(xì)胞生物研究室，河南 鄭州450008

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）是一個高度復(fù)雜的維持蛋白質(zhì)平衡和細(xì)胞活性的體系，通過選擇性周轉(zhuǎn)目標(biāo)底物來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多蛋白的穩(wěn)定，因此UPS參與細(xì)胞的多種功能［1］，如細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成和運動，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］。

19S蛋白酶體中有4個去泛素化酶亞基，其中26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基7（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7，PSMD7）和26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基14（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14，PSMD14）是JAMM家族的去泛素化酶，位于19S蛋白酶體中［3］。對完整的19S蛋白酶體組織結(jié)構(gòu)學(xué)分析表明，在組成蓋子亞復(fù)合體的9個亞基中，PSMD7位于中央核心部位，同時和其他4個亞基相結(jié)合［4］，說明PSMD7在形成19S蛋白酶體結(jié)構(gòu)中起重要作用。PSMD7作為組成19S蛋白酶體結(jié)構(gòu)中的核心成員是否參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及其具體的分子機(jī)制尚不清楚。前期工作中，我們已經(jīng)證實了PSMD7在食管鱗癌細(xì)胞EC9706和Eca109中呈高表達(dá)［5］。因此，本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測食管鱗癌及其癌旁正常組織標(biāo)本中PSMD7的mRNA及蛋白表達(dá)情況。在食管鱗癌細(xì)胞TE-1中，用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)PSMD7的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖及凋亡的變化，建立PSMD7表達(dá)量與腫瘤惡性程度之間的關(guān)系，為進(jìn)一步確定PSMD7作為腫瘤治療的靶點提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

TRIzol購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green購自寶生物工程（大連）有限公司，蛋白提取試劑盒購自美國Solarbio公司，鼠抗人PSMD7單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體和免疫組織化學(xué)SP試劑盒購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，Western blot相關(guān)試劑和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自美國Solarbio公司，CCK-8試劑盒購自美國Beyotime Inst Biotech公司，Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國KeyGEN Biotech公司，細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 標(biāo)本來源

本研究所采用的30例標(biāo)本均采自河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院2016—2017年間未經(jīng)放療和化療的食管鱗癌手術(shù)患者，其中男性17例，女性13 例，年齡35～72歲（平均52.4歲）。手術(shù)后立即將新鮮標(biāo)本進(jìn)行液氮凍存，每例標(biāo)本均取癌組織及其癌旁組織（距原發(fā)灶邊緣5 cm以上）。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 方法

1.2.1 RTFQ-PCR檢測PSMD7的基因表達(dá)

采用TRIzol提取組織標(biāo)本的總RNA，mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，分別用PSMD7和GAPDH進(jìn)行RTFQ-PCR檢測。PSMD7引物：上游5’-CTGTCGTGAGCTGAGATC-3’；下游5’-TCTCAGATTCAAGTGATC-3’。GAPDH引物：上游5’-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’；下游5’-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’。反應(yīng)體系20 μL，在實時熒光定量PCR儀器ABI Q7上設(shè)置如下反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸32 s，共30個循環(huán)，采用2－ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

1.2.2 Western blot檢測PSMD7蛋白水平

提取臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標(biāo)本的蛋白質(zhì)，或離心收集細(xì)胞并提取總蛋白。檢測細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)時，首先用細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞質(zhì)總蛋白，二辛可酸法（bicinchonininc acid，BCA）法測定蛋白濃度，每個標(biāo)本取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉對膜進(jìn)行4 ℃過夜封閉，然后將膜與一抗（PSMD7單克隆抗體，1∶1 000；GAPDH單克隆抗體，1∶2 000；Cyt C單克隆抗體，1∶2 000；cleaved caspase 3單克隆抗體，1∶2 000；cleaved caspase 9單克隆抗體，1∶2 000；PARP單克隆抗體，1∶2 000；Bax單克隆抗體，1∶2 000；Bcl-2單克隆抗體，1∶2 000）4 ℃溫育過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000）室溫下溫育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，計算相對灰度值表示蛋白的相對水平。

1.2.3 慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾PSMD7的表達(dá)與細(xì)胞增殖能力和凋亡的檢測

本研究設(shè)計4條動力學(xué)參數(shù)較優(yōu)的RNA干擾靶點，采用Scramble序列（5’-TTCTCCGAA CGTGTCACGT-3’）作為陰性對照（negative control，NC）。采用HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，收集病毒后用polybrene感染人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1，轉(zhuǎn)染72 h后用RTFQ-PCR和Western blot檢測PSMD7的表達(dá)量。選擇效率最高的RNA干擾靶點進(jìn)行后續(xù)實驗（表1）。

將干擾PSMD7表達(dá)慢病毒（PSMD7-LV-shRNA）和陰性對照慢病毒（NC-LV-shRNA）感染食管鱗癌細(xì)胞TE-1，然后用嘌呤霉素（puromycin）篩選陽性感染細(xì)胞，將細(xì)胞接種在96孔板上，培養(yǎng)至融合度達(dá)80%～90%，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度（D）值，計算抑制PSMD7表達(dá)后TE-1增殖能力的變化。

將慢病毒干擾的陽性細(xì)胞接種在6孔板上，培養(yǎng)至融合度達(dá)80%～90%，胰酶消化后加入Annexin Ⅴ-PE和7-AAD對細(xì)胞進(jìn)行雙染，采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的凋亡情況。

表 1 PSMD7 shRNA靶點序列Tab. 1 Targeting sequence of PSMD7 shRNA

1.2.4 細(xì)胞線粒體膜電位的測定

采用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測未感染組、對照組和干擾組的線粒體膜電位。具體方法參照說明書，收集細(xì)胞，加入JC-1溶液混勻后置37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min之后離心，離心速率為10 000×g，離心5 min收集細(xì)胞，加入2 mL膜電位檢測緩沖溶液，混勻后離心棄上清液，再加入1 mL 膜電位檢測緩沖溶液混勻，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。紅色熒光標(biāo)記正常細(xì)胞線粒體，表示膜電位正常，綠色熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞線粒體，表示膜電位降低。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中兩組之間的比較，每個樣本數(shù)據(jù)用x±s表示，采用t檢驗分析，PSMD7蛋白表達(dá)和臨床病理因素的相關(guān)性采用Spearman分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PSMD7在食管鱗癌組織中的表達(dá)

30例臨床食管鱗癌和癌旁正常食管組織標(biāo)本中PSMD7的mRNA表達(dá)量見圖1A，73.3%（22/30）的標(biāo)本中PSMD7的mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，且PSMD7 mRNA在食管鱗癌和癌旁正常食管組織標(biāo)本中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明大多數(shù)食管鱗癌組織中PSMD7的mRNA表達(dá)增高。

采用Western blot對食管鱗癌標(biāo)本中PSMD7蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，70%（21/30）的食管鱗癌標(biāo)本中PSMD7蛋白呈高表達(dá)，與癌旁正常組織相比，PSMD7在食管鱗癌組織中的表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖1B）。PSMD7蛋白的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤分化程度和TNM分期無關(guān)（P＞0.05，表2）。

圖 1 食管鱗癌組織中PSMD7的表達(dá)Fig. 1 Expression of PSMD7 in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and paracancerous tissues

表 2 PSMD7蛋白表達(dá)與食管鱗癌組織臨床病理特征的相關(guān)性Tab. 2 The correlation of PSMD7 expression and ESCC clinical pathological characteristics

2.2 PSMD7表達(dá)水平對人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1增殖能力和凋亡的影響

將PSMD7-LV-shRNA和NC-LV-shRNA感染人食管鱗癌細(xì)胞系TE-1后，用puromycin篩選陽性感染細(xì)胞（圖2A～D）。設(shè)計的4種RNA慢病毒干擾序列都能顯著降低PSMD7在TE-1中的表達(dá)，其中LV-3的敲減效率最高（圖2E），因此選取LV-3進(jìn)行后續(xù)實驗。Western blot檢測結(jié)果顯示，篩選的PSMD7-LV-shRNA可以顯著降低TE-1細(xì)胞中PSMD7蛋白的表達(dá)（圖2F、G）。

圖 2 慢病毒干擾TE-1細(xì)胞中PSMD7的表達(dá)Fig. 2 Lentiviral-mediated RNAi suppressed mRNA expression of PSMD7 in TE-1 cells

圖 3 干擾TE-1細(xì)胞中PSMD7的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig. 3 Cell proliferation was decreased and apopotosis was induced when PSMD7 expression was inhibited in TE-1 cells

通過CCK-8方法檢測干擾PSMD7的表達(dá)后TE-1細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果顯示，PSMD7干擾組的細(xì)胞增殖能力顯著低于對照組（圖3A），說明抑制PSMD7的表達(dá)可以降低TE-1細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSMD7干擾組的細(xì)胞凋亡率為28.1%（3次取平均值），顯著高于對照組和未轉(zhuǎn)染組（圖3B和3C），說明抑制PSMD7的表達(dá)可以誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞的凋亡。

2.3 干擾PSMD7的表達(dá)對TE-1細(xì)胞線粒體膜電位和Cyt C的影響

細(xì)胞線粒體膜電位測定結(jié)果顯示（圖4A），未處理組TE-1細(xì)胞和對照組細(xì)胞的綠色熒光的比例為2.8%和3.1%，而PSMD7干擾組為37.5%，說明在TE-1細(xì)胞中抑制PSMD7的表達(dá)后線粒體的膜電位顯著降低。我們用Western blot進(jìn)一步檢測了細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)，結(jié)果顯示，與未處理組TE-1細(xì)胞和對照組相比，shRNA組細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)量顯著升高（圖4B和4C），說明抑制PSMD7的表達(dá)增加了線粒體膜的通透性，促進(jìn)Cyt C從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，表明PSMD7可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡。

圖 4 干擾PSMD7的表達(dá)對TE-1細(xì)胞線粒體膜電位和Cyt C的影響Fig. 4 Effects of PSMD7 inhibition on mitochondrial membrane potential and Cyt C expression in TE-1 cells

2.4 干擾PSMD7的表達(dá)對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

抑制PSMD7的表達(dá)后，我們檢測了促細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和PARP的活性降解產(chǎn)物的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)顯著增高，其中cleaved caspase-3增加2.3倍，cleaved caspase-9增加2.0倍（圖5A和5B）。此外，我們檢測了凋亡標(biāo)志物PARP的表達(dá)和裂解情況，PSMD7干擾組的PARP發(fā)生裂解，而未轉(zhuǎn)染組和對照組未見PARP的裂解（圖5C）。

促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與線粒體膜的敏感性密切相關(guān)［6］。我們的研究表明，在TE-1細(xì)胞中抑制PSMD7的表達(dá)使線粒體膜電位增高，膜通透性增強(qiáng)，Cyt C從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，我們進(jìn)一步檢測了這些變化是否影響B(tài)ax和Bcl-2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖6），干擾PSMD7的表達(dá)后Bax的表達(dá)增高，Bcl-2的表達(dá)下降，與對照組相比，Bax/Bcl-2的比值增加了1倍左右，說明抑制PSMD7通過線粒體依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖 5 干擾PSMD7的表達(dá)對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effects of PSMD7 inhibition on the expression of apopotosis-related protein in TE-1

圖 6 干擾PSMD7的表達(dá)對Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of PSMD7 inhibition on the expressions of Bax and Bcl-2 in TE-1

2.5 Caspase抑制劑對PSMD7誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡的影響

本研究采用Caspase抑制劑z-VAD-fmk處理TE-1細(xì)胞抑制Caspase的活性，結(jié)果顯示（圖7），z-VAD-fmk使干擾組的細(xì)胞活力從53%增加至84%，而抑制PSMD7引起的凋亡細(xì)胞從25.5%降為15.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說明抑制PSMD7的表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進(jìn)行的。

圖 7 Caspase抑制劑對PSMD7誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig. 7 Effect of caspase inhibitor on cell proliferation and induction of apopotosis after PSMD7 inhibition in TE-1 cells

3 討 論

20S蛋白酶體的抑制劑硼替佐米被用來治療多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤，但易產(chǎn)生耐藥，且對實體瘤的治療效果差［7］。研究顯示，19S蛋白酶體中的去泛素化酶參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展并可以作為腫瘤治療的靶點，如一些去泛素化酶對腫瘤細(xì)胞活力是必需的，通過改變凋亡因子的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的生存，它們的表達(dá)和腫瘤的惡性程度相關(guān)［8］。在本研究的前期工作中，我們已經(jīng)證實PSMD7在食管鱗癌細(xì)胞EC9706和Eca109中高表達(dá)，且定位發(fā)生改變。慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾PSMD7的表達(dá)可以降低食管鱗癌細(xì)胞的蛋白酶體活性，使泛素化蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生聚集［5］。本研究以臨床采集的腫瘤標(biāo)本為研究對象，發(fā)現(xiàn)73.3%的標(biāo)本中PSMD7的mRNA呈高表達(dá)，70%的標(biāo)本中PSMD7蛋白呈高表達(dá)，并且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與腫瘤的分化程度和TNM分期無關(guān)。這些結(jié)果表明PSMD7的過表達(dá)在食管癌發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用，因此我們對PSMD7在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。

研究顯示，shRNA干擾PSMD7的表達(dá)增加了依賴泛素的GFP報告基因的熒光強(qiáng)度，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，和蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞得到的結(jié)果類似［9］。本研究用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾來抑制TE-1細(xì)胞中PSMD7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)使細(xì)胞的增殖能力下降并且誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，這些現(xiàn)象和蛋白酶體抑制劑的作用類似。對PSMD7的結(jié)構(gòu)分析顯示，JAMM結(jié)構(gòu)域是一個非金屬的無等位酶活性的結(jié)構(gòu)［10］，說明PSMD7可能不直接水解多泛素化蛋白鏈。然而PSMD7卻同時和其他4個亞基相結(jié)合，并位于中央核心部位［4］，說明PSMD7在形成19S蛋白酶體lid結(jié)構(gòu)中起重要作用。因此抑制PSMD7的表達(dá)有可能影響19S蛋白酶體的組裝，并影響其識別和水解多泛素化鏈的功能。我們的前期研究已表明，抑制食管鱗癌細(xì)胞中PSMD7的表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白增加，泛素的熒光增強(qiáng)，并且蛋白酶體的活性降低［5］，說明PSMD7參與維持蛋白酶體的正常功能，因此在TE-1細(xì)胞中抑制PSMD7的表達(dá)得到了類似抑制蛋白酶體活性的結(jié)果。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，是參與細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，在凋亡早期即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變。在外界因子的刺激下，細(xì)胞內(nèi)首先會發(fā)生線粒體膜通透性增加，體現(xiàn)在膜電位下降，使Cyt C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活一系列caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞核發(fā)生凋亡。促凋亡因子Bax可以插入線粒體外膜上誘發(fā)線粒體導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，抗凋亡因子Bcl-2通過穩(wěn)定線粒體膜電位的方式使細(xì)胞避免進(jìn)入凋亡通路［11］。本研究抑制PSMD7的表達(dá)后觀察到細(xì)胞增殖能力下降并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，接著我們研究了這種凋亡是否通過線粒體依賴的方式進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PSMD7的表達(dá)后TE-1細(xì)胞的線粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞質(zhì)中Cyt C的表達(dá)量顯著升高，說明抑制PSMD7的表達(dá)增加了線粒體膜的通透性，并促進(jìn)Cyt C從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。此外，PSMD7干擾組中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)顯著增高，凋亡標(biāo)志物PARP發(fā)生裂解，而未轉(zhuǎn)染組和對照組未見PARP的裂解。干擾PSMD7的表達(dá)后，Bax的表達(dá)增高，Bcl-2的表達(dá)下降，與對照組相比，Bax/Bcl-2的比值增加了1倍，說明PSMD7通過線粒體途徑誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡。Caspase抑制劑z-VAD-fmk使干擾組的細(xì)胞活力恢復(fù)，而抑制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步說明抑制PSMD7的表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過線粒體依賴的方式進(jìn)行的。

本實驗結(jié)果表明，PSMD7在食管鱗癌標(biāo)本中呈高表達(dá)，參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，抑制PSMD7使TE-1細(xì)胞的增殖能力下降，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是以線粒體依賴的方式進(jìn)行的。本研究為進(jìn)一步確定PSMD7作為食管鱗癌治療的靶點提供了依據(jù)。