趙會(huì)君， 馬名立， 代飛燕， 任慧聰

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021)

土壤鹽漬化是土地資源面臨的重大問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)存的不同鹽堿地類型面積大約為9 913萬hm2，主要分布于柴達(dá)木盆地、銀川平原、濱海地區(qū)、河西走廊、新疆等地區(qū)，約占全世界土地面積的25%[1]。寧夏回族自治區(qū)處于溫帶半干旱、干旱區(qū)，位于西北地區(qū)東部、黃河中上游，空氣干旱，降水稀少(平均年降水量為292 mm)，致使蒸發(fā)強(qiáng)烈(水面蒸發(fā)量為 1 296 mm)，近年來由于黃河水的引灌而造成引黃灌區(qū)的土壤鹽漬化問題逐年加重，引起了寧夏回族自治區(qū)政府及有關(guān)人員的高度關(guān)注[2]，寧夏土壤的鹽堿化對(duì)于寧夏的糧食生產(chǎn)和某些作物的種植影響巨大，銀川北部地區(qū)鹽堿地已占總耕地面積的49%以上。水稻是寧夏平原地區(qū)的主栽糧食作物，也是引黃灌區(qū)的重點(diǎn)種植作物，因此篩選抗鹽性較強(qiáng)的水稻品種是利用鹽堿地的重要措施之一[2-3]。

植物一生中對(duì)逆境忍耐力最大的部位是種子，幼苗最小[4-5]。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，水稻種子中含有大量的淀粉顆粒，種子萌發(fā)時(shí)α-淀粉酶就具有活性，并在糊粉層中快速形成而將淀粉水解，α-淀粉酶與赤霉素的調(diào)控有關(guān)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其活性不斷增大[6]。α-淀粉酶的活性越高，種子中的淀粉轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力越強(qiáng)，而鹽脅迫對(duì)α-淀粉酶的影響是研究鹽堿脅迫的重要生理參數(shù)。水稻萌發(fā)期是水稻生長(zhǎng)的起始點(diǎn)，對(duì)植物的后期生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。因此通過對(duì)逆境脅迫下種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的研究，可以篩選一些抗逆性的品種[7]。當(dāng)形態(tài)建成后，幼苗進(jìn)一步受到抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)，在一般鹽脅迫情況下，植物體內(nèi)的過氧化物酶(POD)等的活性和植物的抗氧化脅迫能力呈正相關(guān)，另外，某些植物體內(nèi)的過氧化物質(zhì)如抗壞血酸也有清除體內(nèi)自由基的生理功能[8]。因此，本研究以寧夏主栽水稻品種節(jié)七、寧粳41、寧粳28及日本晴為材料，研究鹽脅迫對(duì)不同水稻品種萌發(fā)期形態(tài)、生理生化指標(biāo)的影響，為后期鹽堿地種質(zhì)資源篩選和寧夏水稻種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子萌發(fā)及形態(tài)指標(biāo)測(cè)量

試驗(yàn)于2017年1—5月在北方民族大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，所選擇的水稻品種主要有寧夏主栽水稻品種寧粳28、寧粳41、節(jié)七及對(duì)照品種日本晴。選取大小均一、籽粒飽滿的種子備用。種子用10%次氯酸鈉消毒10 min，并用蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次，將其依次擺放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放30粒。每個(gè)品種設(shè)置4個(gè)鹽濃度梯度，分別為0(CK)、50、100、150 mmol/L，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放置于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽。發(fā)芽期間每天定時(shí)記錄萌發(fā)數(shù)(以種子露白為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，萌發(fā)第2天開始測(cè)量胚芽鞘長(zhǎng)度(mm)、主根長(zhǎng)度(mm)、胚根數(shù)，每次隨機(jī)挑選10粒進(jìn)行測(cè)量，并計(jì)算各形態(tài)指標(biāo)的平均值，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。萌發(fā)率=發(fā)芽粒數(shù)/供試粒數(shù)×100%。所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

1.2 酶液的提取及同工酶電泳和α-淀粉酶活性的測(cè)定

取處理不同時(shí)間的0.5 g新鮮組織，加入5 mL冰預(yù)冷的 50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH值為7.0)于冰浴中研磨，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，收集上清液即為酶粗提液，可溶性總蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。同工酶電泳采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的垂直板凝膠電泳儀，電泳時(shí)α-同工酶、超氧化物歧化酶(SOD)、POD以及過氧化氫酶(CAT)采用10%分離膠和5%濃縮膠，總上樣量為 35 μL，預(yù)電泳10 min，濃縮膠中穩(wěn)定電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后穩(wěn)定電壓為120 V，電流為200 mA。于冰浴中電泳3～4 h后當(dāng)指示染料下行至距膠板末端1～2 cm時(shí)停止電泳。

α-淀粉酶同工酶染色采用淀粉法[7]，SOD同工酶染色采用氮藍(lán)四唑法[9]，POD同工酶染色采用醋酸-聯(lián)苯胺法[10]，CAT染色采用淀粉法[11]。根據(jù)染色的酶譜計(jì)算相對(duì)遷移率Rf(Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理濃度和時(shí)間下4個(gè)水稻品種的萌發(fā)趨勢(shì)

如圖1所示，4個(gè)水稻品種在不同鹽脅迫下的萌發(fā)率隨著鹽濃度的增大而不斷降低，說明鹽脅迫抑制了種子的萌發(fā)，但是節(jié)七在5 d內(nèi)的萌發(fā)趨勢(shì)基本一致(圖1-a)，在最高濃度的鹽脅迫下第2天萌發(fā)率就已達(dá)到78%，寧粳28的萌發(fā)率在第2天達(dá)到50%左右，寧粳41的萌發(fā)率在第4天達(dá)到30%左右，而日本晴在第4天才開始發(fā)芽。這顯示節(jié)七在高濃度的鹽脅迫下保持了較高的萌發(fā)率，可能對(duì)鹽脅迫有較高的抗性。

2.2 不同水稻品種在鹽脅迫下萌發(fā)形態(tài)的差異

如表1所示，與對(duì)照相比，所有品種經(jīng)過鹽脅迫后，胚芽鞘長(zhǎng)和胚根數(shù)、胚根長(zhǎng)都受到極顯著抑制(P<0.001)，而寧粳41和寧粳28以及節(jié)七品種相比日本晴，抑制程度較輕，這表現(xiàn)在胚芽鞘長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)受抑制程度上，這些形態(tài)指標(biāo)是早期鑒定傷害的重要指標(biāo)。

表1 萌發(fā)第3天的形態(tài)指標(biāo)

注：所有數(shù)據(jù)來源于3次重復(fù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，大寫字母A表示與CK相比在0.001水平差異顯著。

2.3 不同鹽濃度處理對(duì)節(jié)七α-淀粉酶同工酶的影響

以鹽脅迫下萌發(fā)率較高的品種節(jié)七為研究材料，α-淀粉酶-同工酶圖譜如圖2所示。由圖2可以看出，在非脅迫情況下，在萌發(fā)第1天，種子中出現(xiàn)了1條遷移率為0.34的條帶，在萌發(fā)第2天，出現(xiàn)了2條遷移率分別為0.34、0.43的條帶，顯示種子中的淀粉酶隨著萌發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)條帶增多和強(qiáng)度增加的趨勢(shì)。在鹽脅迫條件下，萌發(fā)第1天，α-淀粉酶-同工酶出現(xiàn)被抑制的現(xiàn)象，表現(xiàn)在隨著鹽脅迫時(shí)間延長(zhǎng)及濃度的增加，酶帶亮度減小，寬度減少，說明鹽脅迫導(dǎo)致α-淀粉酶同工酶活性下降，而在處理第2天，與對(duì)照相比同工酶仍然呈被抑制趨勢(shì)。

2.4 不同濃度處理下節(jié)七抗氧化同工酶的變化情況

由圖3可知，與對(duì)照相比，鹽脅迫后SOD亮度和條帶數(shù)增加，說明SOD同工酶受鹽脅迫的誘導(dǎo)；CAT同工酶第3個(gè)亞基酶帶寬度增加，POD同工酶表現(xiàn)在隨著處理濃度的增加酶帶減少和亮度降低，這顯示POD也受到了抑制。以上結(jié)果說明，鹽脅迫早期就已經(jīng)對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行了修飾，而CAT和SOD可能主要參與了鹽脅迫早期的活性氧物質(zhì)的清除。

3 結(jié)論與討論

土壤理化環(huán)境是影響種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的重要生態(tài)因子，種子的抗逆能力在一定程度上反映了該物種的抗逆程度，植物種子耐鹽性是耐鹽堿植物篩選與早期鑒定的主要依據(jù)之一，種子能否在鹽脅迫下萌發(fā)成苗，幼苗能否順利度過成熟期，是植物在鹽堿條件下生長(zhǎng)發(fā)育的前提，因此，研究鹽脅迫下種子萌發(fā)生理和幼苗生長(zhǎng)具有重要意義[12-14]。篩選抗逆性品種是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的關(guān)鍵因素，這關(guān)系到幼苗的形態(tài)建成以及后期的產(chǎn)量形成。

種子發(fā)芽速率取決于種子吸水速率，種子從外界吸足水分后，貯存在干燥種子中的酶原被激活，種子萌發(fā)所需的酶被合成，種子的萌發(fā)與α-淀粉酶基因的表達(dá)有重要的關(guān)系，而鹽脅迫抑制種子萌發(fā)的重要限制因素就是低水勢(shì)脅迫[14]，本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對(duì)水稻種子中α-淀粉酶同工酶產(chǎn)生了抑制，這是種子萌發(fā)率降低的重要原因之一，這一結(jié)果也與趙會(huì)君等在小麥中的研究結(jié)果[7]相似。鹽脅迫對(duì)水稻萌發(fā)期形態(tài)指標(biāo)的傷害主要表現(xiàn)在胚芽鞘、胚根生長(zhǎng)被抑制和胚根數(shù)減少，這與藺吉祥等的研究結(jié)果[13]相似，可能是過量的Na+在根系的累積導(dǎo)致的毒害癥狀，高濃度的鹽堿脅迫還會(huì)抑制植物根系有絲分裂指數(shù)而抑制根系生長(zhǎng)[15]。而節(jié)七品種在較高濃度的鹽堿脅迫下保持著較高的萌發(fā)勢(shì)，可能對(duì)鹽堿具有較強(qiáng)的耐受性，可以作為重要的抗鹽品種在鹽堿地推廣種植。