陳龍勝， 董先茹， 蔡群興， 劉玉軍， 陳瑞瑞

(1.安徽省科學(xué)技術(shù)研究院，安徽合肥 230031； 2.安徽省應(yīng)用技術(shù)研究院，安徽合肥 230088； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)別稱九華黃精，系百合科黃精屬多年生草本植物。黃精以根狀莖入藥，集藥用、食用、觀賞和美容價(jià)值于一身，在研制新藥和開發(fā)保健品方面具有廣闊應(yīng)用前景[1-3]。多花黃精喜生于緩坡、雜草叢或林下蔭地，種質(zhì)資源分布較廣。

九華山地區(qū)所產(chǎn)多花黃精品質(zhì)上佳，有著悠久的歷史文化淵源，“九華黃精”已經(jīng)成為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品。隨著九華山旅游產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，野生黃精因市場需求量增加而遭大量采挖，使其野生種質(zhì)資源愈來愈少，生態(tài)平衡受到破壞。目前，當(dāng)?shù)厝斯ぴ耘嘀饕捎酶o進(jìn)行無性繁殖，但該方法繁殖系數(shù)低，根莖用種量大，既提高了成本，又限制了多花黃精的種植規(guī)模，且多代根莖繁殖后會(huì)造成病毒的積累和種質(zhì)的退化[4]。因而，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立多花黃精快速繁殖體系是生產(chǎn)黃精種苗的有效途徑。目前，多華黃精的研究主要集中在其成分測(cè)定[5-6]、藥理作用[7]、育苗技術(shù)[8-11]以及傳統(tǒng)人工栽培[12]等方面，而由于種子具有嚴(yán)重的休眠特性，關(guān)于種子組織培養(yǎng)方面的研究內(nèi)容鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)主要研究打破黃精種子休眠技術(shù)，并通過快繁培養(yǎng)擴(kuò)大種苗規(guī)模，進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，最后煉苗完成植株再生全過程，旨在為多花黃精種苗工廠化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)短期內(nèi)繁殖大量種苗的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年10月13日在安徽省青陽縣陵陽鎮(zhèn)分流村黃精種植試驗(yàn)基地，選取生長健壯、無病蟲害的優(yōu)質(zhì)黃精單株，收集成熟的果實(shí)。果實(shí)使用塑料袋密封發(fā)酵10 d后，人工搓洗出種子(圖1)。

1.2 方法

1.2.1 多花黃精種子休眠的打破 將搓洗后得到的多花黃精種子，用多菌靈浸泡消毒8 h后，再用不同的激素組合浸泡 2 h 打破休眠，設(shè)以下處理：(1)300 mg/L GA3+300 mg/L KT；(2)300 mg/L GA3+300 mg/L ZT；(3)300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip；(4)300 mg/L GA3+300 mg/L BA，另設(shè)1組無菌去離子水處理組為對(duì)照，處理完成后，按種子河沙體積比1 ∶3的比例混勻后，調(diào)節(jié)濕度至30%，25 ℃條件下催芽，每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，45 d后開始統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率和污染率。

1.2.2 組培種芽消毒 催芽完成后，選取生長基本一致、芽長約0.5 cm的多花黃精種芽(圖2)作為外植體，使用洗潔精溶液淘洗3遍，流水沖洗4 h，無菌條件下分別使用以下方法做消毒處理：(1)75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min；(2)75%乙醇 30 s+0.1%氯化汞10 min；(3)75%乙醇30 s+0.1%氯化汞 15 min；(4)75%乙醇+0.1%氯化汞5 min+第2天重復(fù)處理1次；(5)75%乙醇+0.1%氯化汞10 min+第2天重復(fù)處理1次。消毒完成后，無菌水洗5遍。接種于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，于溫度25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計(jì)污染率，同時(shí)進(jìn)一步觀察種芽生長情況(圖3)。

1.2.3 快繁培養(yǎng) 將多花黃精芽在無菌條件下接種入各預(yù)先配制的快繁培養(yǎng)基中，快繁培養(yǎng)基設(shè)以下處理：(1)MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(2)MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(3)MS+2 mg/L BA+0.5 mg/L NAA；(4)MS+0.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(5)MS+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(6)MS+1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；(7)MS+0.2 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；(8)MS+0.5 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；(9)MS+1 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA；接種完成后，放入溫度25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計(jì)觀察快繁情況(圖4)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將快繁后的無菌苗分株，轉(zhuǎn)接入預(yù)先配制的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基設(shè)以下處理：(1)MS+1 mg/L NAA+0.1% AC；(2)MS+2 mg/L NAA+0.1% AC；(3)MS+3 mg/L NAA+0.1% AC； (4)MS+1 mg/L IBA+0.1% AC；(5)MS+2 mg/L IBA+0.1% AC；(6)MS+3 mg/L IBA+0.1% AC；(7)MS+1 mg/L BA+2 mg/L NAA+0.1% AC；(8)MS+1 mg/L BA+2 mg/L IBA+0.1% AC；放入溫度 25 ℃、16 h光照、光照度1 200 lx條件下培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計(jì)觀察生根情況(圖5)。

1.2.5 煉苗 待無菌苗在瓶中完成生根，打開瓶蓋3 d，使無菌苗初步適應(yīng)外界環(huán)境，使用營養(yǎng)土、蛭石、沙不同的比例配制生根移栽基質(zhì)，將無菌苗洗凈移栽入基質(zhì)中，每天噴水，保持足夠濕度，45 d后統(tǒng)計(jì)種苗存活情況(圖5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對(duì)種子休眠的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在不使用激素的情況下，多花黃精種子的發(fā)芽率很低，只有約9.3%，且發(fā)芽時(shí)間長，發(fā)芽不整齊(表1)。這說明多花黃精種子具有較強(qiáng)的休眠性，因而自然條件下多花黃精種子無法用于大量繁殖種苗；不同濃度的激素結(jié)合GA3可以有效打破多花黃精種子的休眠，最合適的濃度為300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip的激素處理，其發(fā)芽率達(dá)到91.7%，基本完成了對(duì)種子休眠的打破(表1)。

2.2 種芽消毒方式

研究發(fā)現(xiàn)，氯化汞處理時(shí)間從5 min提高到15 min，染菌率從68.6%降低到9.3%，但是對(duì)種苗的毒害作用也逐漸變大，單獨(dú)處理的效果并不理想。而使用低劑量、重復(fù)次數(shù)可以減少對(duì)種苗的毒害作用，使用75%乙醇30 s+0.1%氯化汞 5 min+ 第2天重復(fù)的處理，可以使種苗的污染率控制在 11.6%，且對(duì)種芽傷害最低，種芽在4 d后就可變綠，展出真葉，綜合來看，使用75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min+第2天重復(fù)是較為合適的消毒處理方法(表2)。

表1 不同激素處理對(duì)種子休眠的影響

表2 種芽消毒方式對(duì)種苗生長的影響

2.3 激素對(duì)組培苗快繁的影響

研究發(fā)現(xiàn)，將成苗的黃精組培苗轉(zhuǎn)接入不同的快繁培養(yǎng)基中后，黃精種芽組培苗對(duì)KT和ZT較敏感，其增殖系數(shù)要高于同濃度的BA，但會(huì)出現(xiàn)大量畸形葉，即使使用濃度較低仍有較多畸形葉片出現(xiàn)(表3)。因此，使用BA要比KT和ZT更適用于多花黃精種苗，結(jié)合增殖系數(shù)和組培苗生長情況，最適宜的快繁培養(yǎng)基為：S+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，此時(shí)可以達(dá)到較好的增殖系數(shù)和組培苗正常的生長。

2.4 激素對(duì)組培苗生根的影響

將快繁后的種苗分株接入不同的生根培養(yǎng)基中后發(fā)現(xiàn)，NAA對(duì)多花黃精組培苗生根效果要好于IBA，而加入少量BA雖然對(duì)老葉片發(fā)黃有一定抑制作用，但會(huì)降低根長和生根數(shù)(表4)。因此，綜合生根效果和經(jīng)濟(jì)性，適宜的生根配方為：MS+2 mg/L NAA+0.1%AC，在此配方下的生根數(shù)達(dá)到 5.5條，根長達(dá)到4.1 cm。

2.5 移栽基質(zhì)對(duì)組培苗煉苗的影響

選取生根基本一致的組培苗進(jìn)行煉苗處理，依次栽種入不同移栽基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沙比蛭石更適合作為多花黃精煉苗基質(zhì)，而同時(shí)加入沙、蛭石和單獨(dú)使用沙對(duì)種苗存活和生長并無明顯差距(表5)。因此，結(jié)合植株存活率和經(jīng)濟(jì)性，在大規(guī)模煉苗生產(chǎn)中應(yīng)選擇泥炭 ∶沙=2 ∶1的移栽基質(zhì)配方，存活率達(dá)到83%以上，能夠達(dá)到移栽種植多花黃精組培苗的要求。

表4 黃精組培苗生根情況

表5 黃精組培苗煉苗情況

3 結(jié)論

本研究表明，多花黃精種子在未處理的自然條件下，發(fā)芽率僅為9.3%，不適合直接進(jìn)行育苗。而以300 mg/L GA3+300 mg/L 2-ip的激素處理，其發(fā)芽率達(dá)到91.7%，達(dá)到了大規(guī)模育苗的要求，是打破多花黃精種子休眠的最佳方式；最佳外植體處理方法75%乙醇30 s+0.1%氯化汞5 min后并在第2天重復(fù)的處理；優(yōu)選的增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，生根培養(yǎng)基為MS+2 mg/L NAA+0.1% AC；煉苗移栽基質(zhì)以泥炭 ∶沙=2 ∶1最佳，成活率可達(dá)83%以上。本試驗(yàn)結(jié)果將為多花黃精規(guī)?；N子育苗、組培育苗和中下游產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供一定技術(shù)基礎(chǔ)。