李躍文，萬強(qiáng)

本研究創(chuàng)新點：

長期服用阿司匹林可損傷人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1），甘草總黃酮具有顯著的胃黏膜保護(hù)和修復(fù)作用，但其對阿司匹林所致胃黏膜損傷的作用尚不清楚。本研究采用阿司匹林誘導(dǎo)GES-1損傷，加入甘草總黃酮和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）阻滯劑PD98059干預(yù)，探討甘草總黃酮對阿司匹林損傷GES-1的保護(hù)作用及機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)甘草總黃酮可顯著降低阿司匹林對GES-1增殖的抑制，減少由阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1凋亡，降低乳酸脫氫酶（LDH）活性及丙二醛（MDA）含量并增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，并降低B淋巴細(xì)胞癌2（Bcl-2）表達(dá)，增加磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK1/2）及Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）表達(dá)；加入PD98059預(yù)處理可進(jìn)一步增強(qiáng)甘草總黃酮上述藥理作用，提示甘草總黃酮可通過促增殖、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等途徑減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1損傷，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號通路有關(guān)。本研究創(chuàng)新點在于發(fā)現(xiàn)甘草總黃酮可通過抑制ERK1/2信號通路減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1損傷，研究結(jié)果有望為甘草總黃酮臨床防治阿司匹林引起的胃黏膜損傷提供一定的實驗依據(jù)。

非甾體抗炎藥如阿司匹林（aspirin）臨床廣泛用于治療風(fēng)濕性疾病及預(yù)防心腦血管疾病，但長期使用可損傷胃黏膜，誘發(fā)潰瘍和出血［1］。因此，積極研究并開發(fā)藥物抑制阿司匹林所致的胃黏膜損傷，具有重要意義。中醫(yī)藥具有胃腸道不良反應(yīng)小的特點，甘草總黃酮（licoflavone）是從豆科多年生草本中藥甘草的根和根莖中分離純化的黃酮制劑，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［2］。既往研究證實甘草總黃酮對慢性淺表性胃炎及慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜損傷均具有顯著的保護(hù)和修復(fù)作用［3-4］，但其對阿司匹林所致胃黏膜損傷的作用尚不清楚。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extra cellular regulated protein kinases，ERK1/2）信號通路與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，并在胃黏膜損傷的病理過程中起了關(guān)鍵作用［5］。本研究采用阿司匹林誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞（gastric epithelial cells，GES-1）損傷，加入甘草總黃酮和ERK1/2阻滯劑PD98059干預(yù)，探討甘草總黃酮對阿司匹林損傷GES-1的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2017年3—11月。

1.2 實驗材料 GES-1細(xì)胞株購于美國菌種保藏中心（ATCC）細(xì)胞庫；甘草總黃酮購于惠州市九惠制藥股份有限公司；阿司匹林（純度≥99%）、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK1/2）抗體、B淋巴細(xì)胞癌2（Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、β-actin抗體購于美國Abcam公司；PD98059購于英國Tocris Bioscience公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購于中國Beyotime公司。

1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡購于德國Leica公司；電泳儀購于美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；冷凍高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.4 方法

1.4.1 GES-1培養(yǎng)及分組 GES-1加含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱。阿司匹林以1%羧甲基纖維素鈉溶解后用DMEM培養(yǎng)液稀釋至18.5 mmol/L。甘草總黃酮以0.1% DMSO溶解，制成母液備用。GES-1分組：對照組：加DMEM培養(yǎng)基；阿司匹林組：阿司匹林18.5 mmol/L與GES-1共同培養(yǎng)24 h［6］；甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組：GES-1分別以甘草總黃酮（3、6、12 mg/L）預(yù)處理2 h后［7］再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培養(yǎng)24 h；PD98059組：GES-1以甘草總黃酮12 mg/L預(yù)處理2 h后，加PD98059 10 μmol/L［8］處理1 h，再加阿司匹林18.5 mmol/L共同培養(yǎng)24 h。

1.4.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 按2×104/孔的密度將GES-1加入96孔板，培養(yǎng)24 h后去血清，加MTT（5 g/L） 20 μl培養(yǎng) 4 h，去除培養(yǎng)液加 DMSO 100 μl振蕩10 min使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=〔1-（A實驗組/A對照組）〕×100%。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 按2×105/孔的密度將GES-1加入12孔板，培養(yǎng)24 h后換不含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心5 min （2 000 r/min，離心半徑6.5 cm）收集細(xì)胞，加Annexin V-FITC、PI各5 μl，流式細(xì)胞儀內(nèi)檢測，分別以Annexin V-FITC及PI單染管為基準(zhǔn)參照，熒光倒置顯微鏡觀察并分析GES-1凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞LDH、SOD活性及MDA含量測定 按1×104/孔的密度將GES-1加入培養(yǎng)皿，收集上清液，刮取GES-1后進(jìn)行細(xì)胞破碎，LDH、SOD活性及MDA含量測定步驟均按試劑盒說明書操作。

1.4.5 Western blotting法 檢 測 p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá) GES-1冰上裂解后取上清為總蛋白，BCA法蛋白定量，12%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）行蛋白電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加一抗（1∶1 000）過夜，次日加二抗（1∶2 000）孵育1 h，暗室中加發(fā)光液，黑白膠片曝光，Quantity One軟件分析條帶灰度，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組細(xì)胞增殖抑制率比較 6組細(xì)胞增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中與對照組比較，阿司匹林組、甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞增殖抑制率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞增殖抑制率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組比較，PD98059組細(xì)胞增殖抑制率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 6組細(xì)胞凋亡率比較 6組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中與對照組比較，阿司匹林組、甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組比較，PD98059組細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 6組細(xì)胞LDH、SOD活性及MDA含量比較 6組細(xì)胞LDH、SOD活性及MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中與對照組比較，阿司匹林組、甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞LDH活性及MDA含量升高、SOD活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞LDH活性及MDA含量降低、SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組比較，PD98059組細(xì)胞LDH活性及MDA含量降低、SOD活性升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 6組細(xì)胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá)比較 6組細(xì)胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中與對照組比較，阿司匹林組、甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)升高，甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)降低，阿司匹林組、甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞Bax表達(dá)升高、Bcl-2表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組、PD98059組細(xì)胞p-ERK1/2、Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與甘草總黃酮低組、甘草總黃酮中組、甘草總黃酮高組比較，PD98059組細(xì)胞p-ERK1/2、Bax表達(dá)降低、Bcl-2表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3、圖1）。

表1 6組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate in GES-1 cells among 6 groups

表1 6組細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of proliferation inhibition rate and apoptosis rate in GES-1 cells among 6 groups

注：與對照組比較，aP＜0.05；與阿司匹林組比較，bP＜0.05；與甘草總黃酮低組比較，cP＜0.05；與甘草總黃酮中組比較，dP＜0.05；與甘草總黃酮高組比較，eP＜0.05

組別 細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞凋亡率對照組 0 4.31±2.09阿司匹林組 41.94±4.05a 45.82±6.38a甘草總黃酮低組 40.52±4.16a 44.61±5.93a甘草總黃酮中組 33.13±5.07ab 33.72±5.17ab甘草總黃酮高組 22.37±4.49ab 26.02±6.06ab PD98059組 14.26±3.36abcde 14.96±4.29abcde F值 22.036 38.785 P 值 ＜0.01 ＜0.01

表2 6組細(xì)胞LDH、SOD活性及MDA含量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of LDH and SOD activities，and MDA content in GES-1 cells among 6 groups

表2 6組細(xì)胞LDH、SOD活性及MDA含量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of LDH and SOD activities，and MDA content in GES-1 cells among 6 groups

注：LDH=乳酸脫氫酶，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛；與對照組比較，aP＜0.05；與阿司匹林組比較，bP＜0.05；與甘草總黃酮低組比較，cP＜0.05；與甘草總黃酮中組比較，dP＜0.05；與甘草總黃酮高組比較，eP＜0.05

組別 LDH（U/L） SOD（U/ml） MDA（μmol/L）對照組 423±81 21.58±2.53 1.28±0.14阿司匹林組 1 297±124a 7.24±1.25a 5.95±0.18a甘草總黃酮低組 1 288±120a 7.29±1.37a 5.89±0.21a甘草總黃酮中組 986±107ab 10.43±1.82ab 3.92±0.23ab甘草總黃酮高組 748±95ab 13.19±2.01ab 2.76±0.15ab PD98059 組 561±93abcde 17.36±2.17abcde 1.98±0.17abcde F值 248.970 139.652 208.606 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 6組細(xì)胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá)比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

表3 6組細(xì)胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá)比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

注：p-ERK1/2=磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，Bcl-2=B淋巴細(xì)胞癌2，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白；與對照組比較，aP＜0.05；與阿司匹林組比較，bP＜0.05；與甘草總黃酮低組比較，cP＜0.05；與甘草總黃酮中組比較，dP＜0.05；與甘草總黃酮高組比較，eP＜0.05

組別 p-ERK1/2 Bcl-2 Bax對照組 0.52±0.07 0.87±0.03 0.23±0.07阿司匹林組 0.89±0.03a 0.34±0.07a 0.82±0.04a甘草總黃酮低組 0.87±0.04a 0.35±0.06a 0.81±0.03a甘草總黃酮中組 0.71±0.05ab 0.48±0.05ab 0.62±0.05ab甘草總黃酮高組 0.43±0.06ab 0.64±0.06ab 0.53±0.06ab PD98059組 0abcde 0.73±0.04abcde 0.34±0.06abcde F值 216.345 138.524 369.236 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 6組細(xì)胞p-ERK1/2、Bcl-2、Bax表達(dá)電泳圖Figure 1 Electrophorogram of the protein expressions of p-ERK1/2，Bcl-2 and Bax in GES-1 cells among 6 groups

3 討論

阿司匹林是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床廣泛用于治療風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)痛，還可抑制血小板聚集，用于預(yù)防和治療腦血栓形成、缺血性心臟病、心絞痛。研究證實長期使用阿司匹林，即使維持低劑量也可造成胃黏膜損傷，誘發(fā)潰瘍和出血［1］。胃黏膜對于維持胃的正常生理功能起了重要作用，胃黏膜上層分泌的黏液可聯(lián)結(jié)胃黏膜上皮細(xì)胞和相鄰細(xì)胞，從而形成具有保護(hù)作用的胃黏膜屏障，防止Na+從黏膜擴(kuò)散至胃腔內(nèi)及H+由胃腔逆向擴(kuò)散至胃黏膜，保護(hù)黏膜下層的細(xì)胞免受胃液分泌胃酸的腐蝕和胃蛋白酶的消化作用，并抵御細(xì)菌及微生物的入侵［9］。既往研究表明阿司匹林可抑制GES-1分泌血小板衍生生長因子AB（platelet-derived growth factor AB，PDGF-AB）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），使GES-1增殖受限，并造成 GES-1損傷［10］。

氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)自由基、活性氧、活性氮產(chǎn)生過多和/或機(jī)體抗氧化能力減弱，使活性氧、活性氮清除降低，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧、活性氮增多，破壞了機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡，造成中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，大量氧化產(chǎn)物生成，最終導(dǎo)致組織、細(xì)胞氧化損傷的病理過程。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的負(fù)面作用，已成為導(dǎo)致胃黏膜損傷的一個重要因素［11］。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和氧自由基反應(yīng)的協(xié)調(diào)與動態(tài)平衡狀態(tài)在維持機(jī)體正常生理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，MDA是不飽和脂肪酸的氧化終產(chǎn)物，也是典型的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物，其含量的高低可反映機(jī)體氧化應(yīng)激病理過程的損傷程度［12］。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除活性氧，減輕氧化應(yīng)激損傷的首要物質(zhì)［13］。LDH是參與糖酵解的重要酶類，細(xì)胞受損時LDH可漏出至細(xì)胞外液中［14］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，阿司匹林處理后，GES-1 LDH活性及MDA含量增加，SOD活性降低，證實阿司匹林可通過氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)GES-1損傷。

GES-1增殖與凋亡的動態(tài)平衡在維護(hù)胃黏膜屏障功能過程中起了至關(guān)重要的作用，此平衡系統(tǒng)的紊亂可誘發(fā)胃黏膜潰瘍和出血［15］。Bcl-2和Bax在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了調(diào)控作用，Bcl-2具有抑制凋亡作用，可以抑制由多種細(xì)胞毒因素所引起的細(xì)胞凋亡，Bcl-2的過度表達(dá)能增強(qiáng)所觀察細(xì)胞對大多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性；Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，是Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡［16］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，阿司匹林處理后GES-1凋亡增加，增殖減少，細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2、Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，證實阿司匹林可通過抑制增殖、調(diào)控Bcl-2及Bax表達(dá)以促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)GES-1損傷。

細(xì)胞的增殖、凋亡等生命活動均受到機(jī)體嚴(yán)格調(diào)控，ERK1/2信號通路可被一系列細(xì)胞外的刺激信號激活并介導(dǎo)信號從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳導(dǎo)，參與了細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程［17］。PD98059是非ATP競爭性ERK1/2阻滯劑，能特異性結(jié)合ERK1/2并使其失活，阻止Raf對ERK1/2的磷酸化和激活［18］。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，阿司匹林組GES-1中p-ERK1/2表達(dá)顯著增加；與阿司匹林組比較，加入甘草總黃酮6、12 mg/L預(yù)處理均可顯著降低阿司匹林對GES-1增殖的抑制，減少由阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1凋亡，降低GES-1 LDH活性及MDA含量并增加SOD活性，增加GES-1中p-ERK1/2及Bax表達(dá)，并降低Bcl-2表達(dá)；與甘草總黃酮高組比較，加入PD98059預(yù)處理可進(jìn)一步增強(qiáng)甘草總黃酮的上述藥理作用，提示甘草總黃酮可通過促增殖、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等途徑減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1損傷，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號通路有關(guān)。甘草總黃酮對阿司匹林誘導(dǎo)GES-1損傷的保護(hù)作用和機(jī)制以及甘草總黃酮對于胃黏膜損傷的臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，甘草總黃酮可通過抑制ERK1/2信號通路減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1損傷，研究結(jié)果有望為甘草總黃酮臨床防治阿司匹林引起的胃黏膜損傷提供一定的實驗依據(jù)。但人體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生命活動的信號通路眾多，ERK1/2信號通路可能只是其中之一，更深入的機(jī)制研究還需要進(jìn)一步探討。

作者貢獻(xiàn)：李躍文進(jìn)行實驗實施、評估、資料收集、撰寫論文、成文；萬強(qiáng)進(jìn)行實驗設(shè)計與實施、進(jìn)行質(zhì)量控制及審校，并對文章負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。