王潔，王蕭楓

（1.瑞安市中醫(yī)院 骨傷科，浙江 溫州 325200；2.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 科教科，浙江 溫州325000）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類生育觀念發(fā)生改變，人口老齡化逐漸加重。目前骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已經(jīng)成為一種十分常見且危及老年人生命健康的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，在世界范圍的疾病中，OP的患病率已經(jīng)躍升至第7位[1]。通常認(rèn)為正常人的第4個(gè)十年是一個(gè)界限，之后骨吸收作用大于骨形成作用，骨量呈持續(xù)性減少，導(dǎo)致OP的發(fā)生。

快速老化型小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）是1968年由日本學(xué)者經(jīng)AKR/J系小鼠的近交繁殖所培育出來的一種能夠快速老化的小鼠模型，按照老化速率可以分為快速老化的P系和正常老化的R系。其P系中的SAMP6小鼠的骨特點(diǎn)與人類老年性O(shè)P的骨特點(diǎn)相似：骨組織的超微結(jié)構(gòu)破壞引起全身廣泛性骨量減少，骨密度減少引起骨骼脆性增加等[2]。3月齡之后的SAMP6小鼠與同時(shí)期的SAMR1小鼠對(duì)比可發(fā)現(xiàn)前者骨量減少，骨皮質(zhì)骨厚度減少且骨骼生物力學(xué)性能顯著下降，是目前僅有的比較符合老年性O(shè)P研究標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物模型[3]。而有關(guān)SAMP6小鼠的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究少有報(bào)道。查閱有關(guān)成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的文獻(xiàn)，本研究擬從新生SAMP6小鼠顱骨提取成骨細(xì)胞并鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康出生3 d的SAMP6小鼠5只，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0010。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：倒置顯微鏡（日本Olympus公司），高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩儀（江蘇培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），液氮生物容器（四川亞西橡型機(jī)器有限公司），PBS（美國(guó)Hyclone公司），alpha-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），雙抗（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（美國(guó)Gibco公司），I型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司），細(xì)胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥有限公司），瑞氏-姬姆薩（R-J）染液（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8測(cè)定試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取5只健康出生3 d的SAMP6小鼠斷頸處死后放于75%乙醇中20 min，然后放入無菌操作箱在無菌條件下取出顱蓋骨。將顱蓋骨放于培養(yǎng)皿上用含1%青霉素、鏈霉素雙抗的PBS液漂洗多次，剪成大小約1 mm×1 mm。將碎塊置于離心管中，加入含0.25% EDTA的胰蛋白酶5 mL，放入37 ℃恒溫水浴鍋中消化20 min，棄消化液。再加入I型膠原酶5 mL，放入37 ℃恒溫振蕩儀中消化1 h。小心收集消化后的上清液放于10 mL離心管，離心后棄上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（含90%α-MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）制成細(xì)胞懸液放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中暫存。將上一步剩余的碎骨塊繼續(xù)消化，重復(fù)上一步的操作。收集上述兩次步驟消化得到的細(xì)胞懸液放在10 mL離心管中，移液槍輕柔重懸細(xì)胞并吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照5×105個(gè)/mL的濃度依次接種于10 cm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1次。

1.2.2 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞傳代：每日或在細(xì)胞換液時(shí)觀察細(xì)胞貼壁情況以及生長(zhǎng)狀態(tài)、有無細(xì)胞污染等情況。待細(xì)胞增殖至約占培養(yǎng)皿底80%的表面積時(shí)，先棄去培養(yǎng)液，再用PBS小心沖洗3次，然后用含0.25% EDTA的胰酶消化1 min，中止消化后收集細(xì)胞懸液離心（1000 r/min，10 min），棄上清液，加適當(dāng)培養(yǎng)液，以一傳三的比例傳代，細(xì)胞傳代后繼續(xù)放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1次。

1.2.3 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞的純化：在P1、P2、P3代細(xì)胞傳代時(shí)，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min后將上清液吸走加入到新的無菌10 cm培養(yǎng)皿中。

1.2.4 R-J染色：將純化后的第3代細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×104個(gè)/mL接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1 mL，以后每3 d換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約占每孔底面積80%時(shí)，棄培養(yǎng)液后用PBS小心沖洗3次，再加甲醇，室溫下固定10 min，棄去甲醇，R-J染液室溫下作用2 min，用蒸餾水沖洗后，將培養(yǎng)板放于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照保存。

1.2.5 茜素紅染色：選24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞，接種、培養(yǎng)方法以及換液頻率同1.2.4。待21 d后，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，再用95%乙醇室溫下固定30 min，棄95%乙醇，用蒸餾水沖洗3次。每孔加入適量茜素紅染液，室溫下靜置30 min，棄染色液時(shí)盡量吸走避免殘留底部影響鏡下觀察，用蒸餾水緩慢沖洗殘留的茜素紅染液。沖洗后肉眼觀察染色情況后再放于倒置相差顯微鏡下觀察染色情況并拍照保存。

1.2.6 ALP染色：選24孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種細(xì)胞，接種、培養(yǎng)方法以及換液頻率同1.2.4。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約占每孔底面積80%時(shí)，按ALP染色試劑盒要求進(jìn)行操作。

1.2.7 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞增殖能力測(cè)定（繪制生長(zhǎng)曲線）：取純化后的第3代成骨細(xì)胞，按照上述步驟消化后接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種濃度為：2×103個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔，每組共7孔。剩余未加細(xì)胞懸液的孔加入每孔200 μL的PBS。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日換液1次。每日測(cè)定7個(gè)孔中細(xì)胞的OD值。小心吸走每孔的培養(yǎng)液，PBS清洗后，每孔加入10 μL 含CCK-8溶液和90 μL培養(yǎng)基的混合溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。酶標(biāo)儀設(shè)置條件為450 nm處的吸光度，參比波長(zhǎng)620 nm，測(cè)得每日7孔細(xì)胞OD值，生長(zhǎng)曲線的繪制方法：縱坐標(biāo)為每日平均OD值，橫坐標(biāo)為測(cè)定的天數(shù)，用CCK-8法連續(xù)檢測(cè)8 d。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察SAMP6小鼠成骨細(xì)胞形態(tài) 原代的SAMP6小鼠成骨細(xì)胞接種24 h后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁，少部分細(xì)胞仍懸浮，貼壁的細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，大致有三角形、多角形、梭形等（見圖1A）。6 d時(shí)，貼壁的細(xì)胞互相連接成片甚至重疊生長(zhǎng)，整體外觀呈鋪路石狀（見圖1B）。傳代后的細(xì)胞形態(tài)仍以不規(guī)則形、三角形、梭形為主，有的細(xì)胞突起較多，繼續(xù)培養(yǎng)融合后總體外觀呈鋪路石樣。

圖1 原代SAMP6小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)24 h和6 d時(shí)的形態(tài)觀察（×40）

2.2 R-J染色結(jié)果 鏡下觀察到R-J染色后的細(xì)胞胞漿被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，細(xì)胞中可見圓形或橢圓狀的1～3個(gè)核仁（見圖2），細(xì)胞形狀多樣化，主要為三角形、梭形、多角形。

2.3 茜素紅染色結(jié)果 連續(xù)培養(yǎng)21 d后的細(xì)胞匯合密集，并且層層重疊生長(zhǎng)，肉眼下及鏡下可見到伴有不透明的鈣化結(jié)節(jié)覆蓋生長(zhǎng)在細(xì)胞上面，茜素紅染色后鏡下觀察到不透明的鈣化結(jié)節(jié)顏色變成橘紅色（見圖3）。表明分離得到的成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)具有礦化的特征。

2.4 ALP染色結(jié)果 ALP染色后鏡下觀察可見細(xì)胞漿被染成紫紅色，胞內(nèi)紫藍(lán)色顆粒分布，大量陽性細(xì)胞出現(xiàn)（見圖4）。表明分離得到的成骨細(xì)胞具有合成分泌ALP的功能。

圖2 第3代SAMP6小鼠成骨細(xì)胞R-J染色結(jié)果（×100）

圖3 第3代SAMP6小鼠成骨細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果（×100）

圖4 第3代SAMP6小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)ALP染色結(jié)果（×100）

2.5 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)特性 每日用CCK-8測(cè)定細(xì)胞的OD值，分析數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種的前3 d為適應(yīng)期，此時(shí)生長(zhǎng)曲線平緩，第3～第7天生長(zhǎng)曲線基本為線性曲線，進(jìn)入細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。7 d后隨著細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期的到來細(xì)胞增殖較對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期明顯減緩，生長(zhǎng)曲線因此變得相對(duì)平緩（見圖5）。表明分離得到的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本呈“S”形。

3 討論

圖5 SAMP6小鼠成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

3.1 SAMP6小鼠 SAMP6小鼠是目前公認(rèn)針對(duì)老年性O(shè)P研究較為理想的動(dòng)物模型[4]。與其他模擬老年性O(shè)P的動(dòng)物模型相比，SAMP6小鼠有穩(wěn)定的遺傳性能，骨骼微觀退化改變與人類老年性O(shè)P的病理改變比較相似。目前，有關(guān)SAMP6小鼠多從其骨形態(tài)、骨密度、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨的礦化、骨小梁密度等作為研究方向。楊燚等[5]研究SAMP6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅有明顯的成骨分化障礙而且存在衰老加速，這可能是SAMP6小鼠模擬老年性O(shè)P的機(jī)制。SAMP6小鼠的長(zhǎng)骨中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)其與臨床上老年性O(shè)P患者情況較一致[6]。趙延蕾等[7]用鯽魚卵唾液酸糖蛋白治療雄性SAMP6小鼠由骨丟失引起的OP，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠松質(zhì)骨出現(xiàn)嚴(yán)重的骨量丟失和結(jié)構(gòu)退變。UEDA等[8]研究發(fā)現(xiàn)將SAMP6小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注入C57BL/6J小鼠的骨髓髓腔，C57BL/6J小鼠在1個(gè)月后也出現(xiàn)OP的表現(xiàn)，兩者體內(nèi)IL-11基因的表達(dá)水平均顯著下降。

而SAMP6小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定的報(bào)道較少見。故本研究以SAMP6小鼠的成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，采用體外分離培養(yǎng)新生的SAMP6小鼠顱蓋骨的成骨細(xì)胞的方法，進(jìn)行OP機(jī)制的研究。

3.2 成骨細(xì)胞的來源 從動(dòng)物或者活體的骨、骨膜以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取得到成骨細(xì)胞是目前常用的研究體外成骨細(xì)胞生理病理的3種來源。有學(xué)者用SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離后成功誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞[9]。而有觀點(diǎn)認(rèn)為顱骨來源的成骨細(xì)胞在分化能力上要優(yōu)于骨膜來源的成骨細(xì)胞[10]。孫正義等[11]為了探究不同部位取材獲得的成骨細(xì)胞功能差異，通過引產(chǎn)胎兒各個(gè)部位的取材來培養(yǎng)成骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，不同的解剖部位得到的成骨細(xì)胞的分化能力差異較大，引產(chǎn)胎兒骨膜來源的成骨細(xì)胞內(nèi)ALP和骨鈣素含量顯著高于顱蓋骨來源的成骨細(xì)胞。目前普遍采用分離新生動(dòng)物的顱蓋骨來作為成骨細(xì)胞的來源[12-14]。故本研究通過用新生SAMP6小鼠的顱蓋骨分離得到成骨細(xì)胞。

3.3 成骨細(xì)胞的消化方法 成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法目前主要有3種，分別為組織塊培養(yǎng)法、酶消化法和改良酶消化法[15]。組織塊培養(yǎng)法雖然簡(jiǎn)便廉價(jià)且細(xì)胞純度較高，但是成骨細(xì)胞爬行周期需要較多的時(shí)間且數(shù)量相對(duì)偏少[16]。而酶消化法中胰蛋白酶的消化時(shí)間也因不同組織對(duì)其耐受程度有差異而不同，大多數(shù)文獻(xiàn)中胰酶的消化時(shí)間不超過20 min，以避免產(chǎn)生細(xì)胞破壞，并且在37 ℃時(shí)胰酶的消化力最強(qiáng)。關(guān)于成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究中2次消化時(shí)I型膠原酶、II型膠原酶的應(yīng)用均有報(bào)道，但膠原酶的消化時(shí)間以及消化次數(shù)等存在差異。湯小康等[17]用I型和II型膠原酶分別消化新生SD大鼠的顱骨，得出兩者均可用于成骨細(xì)胞的原代消化，但當(dāng)條件變?yōu)槊看蜗? h，共消化2次時(shí)，I型膠原酶作用更強(qiáng)，可能的原因?yàn)镮型膠原基質(zhì)比II型膠原基質(zhì)在大鼠骨組織含量更多。故本研究選用I型膠原酶消化新生SAMP6小鼠的顱骨，條件設(shè)置為消化1 h，共消化2次，收集2次得到的細(xì)胞。為避免細(xì)菌污染，在機(jī)械法分離新生SAMP6小鼠顱骨后用含1%青霉素、鏈霉素雙抗的PBS溶液反復(fù)沖洗。實(shí)驗(yàn)過程中胰蛋白酶很容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的毒性反應(yīng)，所以胰蛋白酶消化的時(shí)間縮短到20 min。消化得到的細(xì)胞難免有雜質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)盡可能減少以避免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在每次傳代時(shí)利用差速貼壁法純化成骨細(xì)胞，原理是成纖維細(xì)胞比成骨細(xì)胞在消化時(shí)更易脫壁，而終止消化后更易貼壁。

3.4 成骨細(xì)胞的鑒定 體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞必須保持其在體內(nèi)表現(xiàn)的生物性能和狀態(tài)。本研究分離獲得的SAMP6小鼠成骨細(xì)胞貼壁24 h后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形狀各異，主要有三角形、梭形、多角形等，貼壁的細(xì)胞互相連接成片甚至重疊生長(zhǎng)，整體外觀呈鋪路石狀。符合大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)[18]。經(jīng)R-J染色后鏡下觀察呈三角形、梭形、多角形等多種形態(tài)，胞漿被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，可見圓形或橢圓形狀的1～3個(gè)核仁位于細(xì)胞中。許兵等[19]用R-J染色觀察成骨細(xì)胞形態(tài)顯示細(xì)胞核呈現(xiàn)紫褐色，胞漿分布藍(lán)色顆粒。本研究中SAPM6小鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示：細(xì)胞貼壁后前3 d生長(zhǎng)曲線較平緩，說明細(xì)胞增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，3～7 d是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，與前3 d比較可見生長(zhǎng)曲線基本為線性曲線。7 d后曲線變得相對(duì)平坦，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期的到來細(xì)胞增殖減緩。

對(duì)成骨細(xì)胞的鑒定除了觀察其形狀特征外，還可從其所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)來判斷其成骨能力。相關(guān)文獻(xiàn)[20]報(bào)道活體內(nèi)的成骨細(xì)胞活躍時(shí)可以分泌出大量的ALP，而體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞也應(yīng)具有這一功能，并且經(jīng)過ALP染色可以呈現(xiàn)陽性表現(xiàn)。本研究對(duì)得到的SAMP6小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行ALP染色后鏡下觀察可見細(xì)胞漿內(nèi)呈紫藍(lán)色及紫藍(lán)色顆粒，表明大量陽性細(xì)胞出現(xiàn)。成骨細(xì)胞在分化的晚期還具有礦化的特點(diǎn)是其促進(jìn)骨形成的重要表現(xiàn)，肉眼下可見許多不透明鈣化結(jié)節(jié)[21]。本研究中，連續(xù)培養(yǎng)21 d后的成骨細(xì)胞匯合密集，并且層層重疊生長(zhǎng)，肉眼下及鏡下可見到伴有不透明的鈣化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色后鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)被染成橘紅色，基本符合體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞生物學(xué)性能。

綜上所述，本研究采用傳統(tǒng)的酶消化法分離SAMP6新生小鼠顱骨的成骨細(xì)胞，通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示所提取的成骨細(xì)胞有穩(wěn)定的增殖能力。經(jīng)鑒定其形態(tài)功能良好，生物特性穩(wěn)定，且具有大多文獻(xiàn)中報(bào)道的成骨細(xì)胞的特征，符合體外細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞的要求。