王潔，王蕭楓

（1.瑞安市中醫(yī)院 骨傷科，浙江 溫州 325200；2.溫州市中西醫(yī)結合醫(yī)院 科教科，浙江 溫州325000）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人類生育觀念發(fā)生改變，人口老齡化逐漸加重。目前骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已經(jīng)成為一種十分常見且危及老年人生命健康的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，在世界范圍的疾病中，OP的患病率已經(jīng)躍升至第7位[1]。通常認為正常人的第4個十年是一個界限，之后骨吸收作用大于骨形成作用，骨量呈持續(xù)性減少，導致OP的發(fā)生。

快速老化型小鼠（senescence accelerated mouse，SAM）是1968年由日本學者經(jīng)AKR/J系小鼠的近交繁殖所培育出來的一種能夠快速老化的小鼠模型，按照老化速率可以分為快速老化的P系和正常老化的R系。其P系中的SAMP6小鼠的骨特點與人類老年性OP的骨特點相似：骨組織的超微結構破壞引起全身廣泛性骨量減少，骨密度減少引起骨骼脆性增加等[2]。3月齡之后的SAMP6小鼠與同時期的SAMR1小鼠對比可發(fā)現(xiàn)前者骨量減少，骨皮質(zhì)骨厚度減少且骨骼生物力學性能顯著下降，是目前僅有的比較符合老年性OP研究標準的動物模型[3]。而有關SAMP6小鼠的成骨細胞體外培養(yǎng)的研究少有報道。查閱有關成骨細胞體外培養(yǎng)的文獻，本研究擬從新生SAMP6小鼠顱骨提取成骨細胞并鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康出生3 d的SAMP6小鼠5只，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0010。

1.1.2 實驗試劑與儀器：倒置顯微鏡（日本Olympus公司），高速離心機（德國Eppendorf公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩儀（江蘇培英實驗設備有限公司），超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），液氮生物容器（四川亞西橡型機器有限公司），PBS（美國Hyclone公司），alpha-MEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料公司），雙抗（美國Gibco公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（美國Gibco公司），I型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司），細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性染色試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥有限公司），瑞氏-姬姆薩（R-J）染液（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8測定試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司），茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SAMP6小鼠成骨細胞的分離和培養(yǎng)：取5只健康出生3 d的SAMP6小鼠斷頸處死后放于75%乙醇中20 min，然后放入無菌操作箱在無菌條件下取出顱蓋骨。將顱蓋骨放于培養(yǎng)皿上用含1%青霉素、鏈霉素雙抗的PBS液漂洗多次，剪成大小約1 mm×1 mm。將碎塊置于離心管中，加入含0.25% EDTA的胰蛋白酶5 mL，放入37 ℃恒溫水浴鍋中消化20 min，棄消化液。再加入I型膠原酶5 mL，放入37 ℃恒溫振蕩儀中消化1 h。小心收集消化后的上清液放于10 mL離心管，離心后棄上清液，加入細胞培養(yǎng)液（含90%α-MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）制成細胞懸液放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中暫存。將上一步剩余的碎骨塊繼續(xù)消化，重復上一步的操作。收集上述兩次步驟消化得到的細胞懸液放在10 mL離心管中，移液槍輕柔重懸細胞并吹打均勻，細胞計數(shù)后按照5×105個/mL的濃度依次接種于10 cm培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1次。

1.2.2 SAMP6小鼠成骨細胞傳代：每日或在細胞換液時觀察細胞貼壁情況以及生長狀態(tài)、有無細胞污染等情況。待細胞增殖至約占培養(yǎng)皿底80%的表面積時，先棄去培養(yǎng)液，再用PBS小心沖洗3次，然后用含0.25% EDTA的胰酶消化1 min，中止消化后收集細胞懸液離心（1000 r/min，10 min），棄上清液，加適當培養(yǎng)液，以一傳三的比例傳代，細胞傳代后繼續(xù)放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1次。

1.2.3 SAMP6小鼠成骨細胞的純化：在P1、P2、P3代細胞傳代時，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min后將上清液吸走加入到新的無菌10 cm培養(yǎng)皿中。

1.2.4 R-J染色：將純化后的第3代細胞計數(shù)后以1×104個/mL接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1 mL，以后每3 d換液。待細胞生長融合至約占每孔底面積80%時，棄培養(yǎng)液后用PBS小心沖洗3次，再加甲醇，室溫下固定10 min，棄去甲醇，R-J染液室溫下作用2 min，用蒸餾水沖洗后，將培養(yǎng)板放于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)并拍照保存。

1.2.5 茜素紅染色：選24孔細胞培養(yǎng)板接種細胞，接種、培養(yǎng)方法以及換液頻率同1.2.4。待21 d后，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，再用95%乙醇室溫下固定30 min，棄95%乙醇，用蒸餾水沖洗3次。每孔加入適量茜素紅染液，室溫下靜置30 min，棄染色液時盡量吸走避免殘留底部影響鏡下觀察，用蒸餾水緩慢沖洗殘留的茜素紅染液。沖洗后肉眼觀察染色情況后再放于倒置相差顯微鏡下觀察染色情況并拍照保存。

1.2.6 ALP染色：選24孔細胞培養(yǎng)板接種細胞，接種、培養(yǎng)方法以及換液頻率同1.2.4。待細胞生長融合至約占每孔底面積80%時，按ALP染色試劑盒要求進行操作。

1.2.7 SAMP6小鼠成骨細胞增殖能力測定（繪制生長曲線）：取純化后的第3代成骨細胞，按照上述步驟消化后接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，接種濃度為：2×103個細胞/100 μL/孔，每組共7孔。剩余未加細胞懸液的孔加入每孔200 μL的PBS。將96孔細胞培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日換液1次。每日測定7個孔中細胞的OD值。小心吸走每孔的培養(yǎng)液，PBS清洗后，每孔加入10 μL 含CCK-8溶液和90 μL培養(yǎng)基的混合溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。酶標儀設置條件為450 nm處的吸光度，參比波長620 nm，測得每日7孔細胞OD值，生長曲線的繪制方法：縱坐標為每日平均OD值，橫坐標為測定的天數(shù)，用CCK-8法連續(xù)檢測8 d。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察SAMP6小鼠成骨細胞形態(tài) 原代的SAMP6小鼠成骨細胞接種24 h后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，少部分細胞仍懸浮，貼壁的細胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，大致有三角形、多角形、梭形等（見圖1A）。6 d時，貼壁的細胞互相連接成片甚至重疊生長，整體外觀呈鋪路石狀（見圖1B）。傳代后的細胞形態(tài)仍以不規(guī)則形、三角形、梭形為主，有的細胞突起較多，繼續(xù)培養(yǎng)融合后總體外觀呈鋪路石樣。

圖1 原代SAMP6小鼠成骨細胞培養(yǎng)24 h和6 d時的形態(tài)觀察（×40）

2.2 R-J染色結果 鏡下觀察到R-J染色后的細胞胞漿被染成紫藍色，細胞核被染成深藍色，細胞中可見圓形或橢圓狀的1～3個核仁（見圖2），細胞形狀多樣化，主要為三角形、梭形、多角形。

2.3 茜素紅染色結果 連續(xù)培養(yǎng)21 d后的細胞匯合密集，并且層層重疊生長，肉眼下及鏡下可見到伴有不透明的鈣化結節(jié)覆蓋生長在細胞上面，茜素紅染色后鏡下觀察到不透明的鈣化結節(jié)顏色變成橘紅色（見圖3）。表明分離得到的成骨細胞體外培養(yǎng)具有礦化的特征。

2.4 ALP染色結果 ALP染色后鏡下觀察可見細胞漿被染成紫紅色，胞內(nèi)紫藍色顆粒分布，大量陽性細胞出現(xiàn)（見圖4）。表明分離得到的成骨細胞具有合成分泌ALP的功能。

圖2 第3代SAMP6小鼠成骨細胞R-J染色結果（×100）

圖3 第3代SAMP6小鼠成骨細胞茜素紅染色結果（×100）

圖4 第3代SAMP6小鼠成骨細胞培養(yǎng)ALP染色結果（×100）

2.5 SAMP6小鼠成骨細胞生長特性 每日用CCK-8測定細胞的OD值，分析數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)細胞接種的前3 d為適應期，此時生長曲線平緩，第3～第7天生長曲線基本為線性曲線，進入細胞的對數(shù)生長期。7 d后隨著細胞生長平臺期的到來細胞增殖較對數(shù)生長期明顯減緩，生長曲線因此變得相對平緩（見圖5）。表明分離得到的成骨細胞生長曲線基本呈“S”形。

3 討論

圖5 SAMP6小鼠成骨細胞的生長曲線

3.1 SAMP6小鼠 SAMP6小鼠是目前公認針對老年性OP研究較為理想的動物模型[4]。與其他模擬老年性OP的動物模型相比，SAMP6小鼠有穩(wěn)定的遺傳性能，骨骼微觀退化改變與人類老年性OP的病理改變比較相似。目前，有關SAMP6小鼠多從其骨形態(tài)、骨密度、骨髓間充質(zhì)干細胞、骨的礦化、骨小梁密度等作為研究方向。楊燚等[5]研究SAMP6小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞不僅有明顯的成骨分化障礙而且存在衰老加速，這可能是SAMP6小鼠模擬老年性OP的機制。SAMP6小鼠的長骨中分離骨髓間充質(zhì)干細胞的研究發(fā)現(xiàn)其與臨床上老年性OP患者情況較一致[6]。趙延蕾等[7]用鯽魚卵唾液酸糖蛋白治療雄性SAMP6小鼠由骨丟失引起的OP，與正常對照組相比，模型對照組小鼠松質(zhì)骨出現(xiàn)嚴重的骨量丟失和結構退變。UEDA等[8]研究發(fā)現(xiàn)將SAMP6小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞直接注入C57BL/6J小鼠的骨髓髓腔，C57BL/6J小鼠在1個月后也出現(xiàn)OP的表現(xiàn)，兩者體內(nèi)IL-11基因的表達水平均顯著下降。

而SAMP6小鼠成骨細胞培養(yǎng)及鑒定的報道較少見。故本研究以SAMP6小鼠的成骨細胞為研究對象，采用體外分離培養(yǎng)新生的SAMP6小鼠顱蓋骨的成骨細胞的方法，進行OP機制的研究。

3.2 成骨細胞的來源 從動物或者活體的骨、骨膜以及骨髓間充質(zhì)干細胞分離提取得到成骨細胞是目前常用的研究體外成骨細胞生理病理的3種來源。有學者用SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離后成功誘導為成骨細胞[9]。而有觀點認為顱骨來源的成骨細胞在分化能力上要優(yōu)于骨膜來源的成骨細胞[10]。孫正義等[11]為了探究不同部位取材獲得的成骨細胞功能差異，通過引產(chǎn)胎兒各個部位的取材來培養(yǎng)成骨細胞后發(fā)現(xiàn)，不同的解剖部位得到的成骨細胞的分化能力差異較大，引產(chǎn)胎兒骨膜來源的成骨細胞內(nèi)ALP和骨鈣素含量顯著高于顱蓋骨來源的成骨細胞。目前普遍采用分離新生動物的顱蓋骨來作為成骨細胞的來源[12-14]。故本研究通過用新生SAMP6小鼠的顱蓋骨分離得到成骨細胞。

3.3 成骨細胞的消化方法 成骨細胞的原代培養(yǎng)方法目前主要有3種，分別為組織塊培養(yǎng)法、酶消化法和改良酶消化法[15]。組織塊培養(yǎng)法雖然簡便廉價且細胞純度較高，但是成骨細胞爬行周期需要較多的時間且數(shù)量相對偏少[16]。而酶消化法中胰蛋白酶的消化時間也因不同組織對其耐受程度有差異而不同，大多數(shù)文獻中胰酶的消化時間不超過20 min，以避免產(chǎn)生細胞破壞，并且在37 ℃時胰酶的消化力最強。關于成骨細胞體外培養(yǎng)的研究中2次消化時I型膠原酶、II型膠原酶的應用均有報道，但膠原酶的消化時間以及消化次數(shù)等存在差異。湯小康等[17]用I型和II型膠原酶分別消化新生SD大鼠的顱骨，得出兩者均可用于成骨細胞的原代消化，但當條件變?yōu)槊看蜗? h，共消化2次時，I型膠原酶作用更強，可能的原因為I型膠原基質(zhì)比II型膠原基質(zhì)在大鼠骨組織含量更多。故本研究選用I型膠原酶消化新生SAMP6小鼠的顱骨，條件設置為消化1 h，共消化2次，收集2次得到的細胞。為避免細菌污染，在機械法分離新生SAMP6小鼠顱骨后用含1%青霉素、鏈霉素雙抗的PBS溶液反復沖洗。實驗過程中胰蛋白酶很容易對細胞產(chǎn)生不可逆的毒性反應，所以胰蛋白酶消化的時間縮短到20 min。消化得到的細胞難免有雜質(zhì)細胞，應盡可能減少以避免影響后續(xù)實驗，在每次傳代時利用差速貼壁法純化成骨細胞，原理是成纖維細胞比成骨細胞在消化時更易脫壁，而終止消化后更易貼壁。

3.4 成骨細胞的鑒定 體外培養(yǎng)的成骨細胞必須保持其在體內(nèi)表現(xiàn)的生物性能和狀態(tài)。本研究分離獲得的SAMP6小鼠成骨細胞貼壁24 h后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞形狀各異，主要有三角形、梭形、多角形等，貼壁的細胞互相連接成片甚至重疊生長，整體外觀呈鋪路石狀。符合大多數(shù)文獻報道的體外培養(yǎng)成骨細胞的形態(tài)特點[18]。經(jīng)R-J染色后鏡下觀察呈三角形、梭形、多角形等多種形態(tài)，胞漿被染成紫藍色，細胞核被染成深藍色，可見圓形或橢圓形狀的1～3個核仁位于細胞中。許兵等[19]用R-J染色觀察成骨細胞形態(tài)顯示細胞核呈現(xiàn)紫褐色，胞漿分布藍色顆粒。本研究中SAPM6小鼠成骨細胞生長曲線顯示：細胞貼壁后前3 d生長曲線較平緩，說明細胞增長相對緩慢，3～7 d是細胞的對數(shù)生長，與前3 d比較可見生長曲線基本為線性曲線。7 d后曲線變得相對平坦，隨著細胞生長平臺期的到來細胞增殖減緩。

對成骨細胞的鑒定除了觀察其形狀特征外，還可從其所分泌的細胞外基質(zhì)來判斷其成骨能力。相關文獻[20]報道活體內(nèi)的成骨細胞活躍時可以分泌出大量的ALP，而體外分離培養(yǎng)的成骨細胞也應具有這一功能，并且經(jīng)過ALP染色可以呈現(xiàn)陽性表現(xiàn)。本研究對得到的SAMP6小鼠成骨細胞進行ALP染色后鏡下觀察可見細胞漿內(nèi)呈紫藍色及紫藍色顆粒，表明大量陽性細胞出現(xiàn)。成骨細胞在分化的晚期還具有礦化的特點是其促進骨形成的重要表現(xiàn)，肉眼下可見許多不透明鈣化結節(jié)[21]。本研究中，連續(xù)培養(yǎng)21 d后的成骨細胞匯合密集，并且層層重疊生長，肉眼下及鏡下可見到伴有不透明的鈣化結節(jié)形成，茜素紅染色后鏡下觀察鈣化結節(jié)被染成橘紅色，基本符合體外培養(yǎng)的成骨細胞生物學性能。

綜上所述，本研究采用傳統(tǒng)的酶消化法分離SAMP6新生小鼠顱骨的成骨細胞，通過細胞生長曲線顯示所提取的成骨細胞有穩(wěn)定的增殖能力。經(jīng)鑒定其形態(tài)功能良好，生物特性穩(wěn)定，且具有大多文獻中報道的成骨細胞的特征，符合體外細胞生物學評價實驗中對細胞的要求。