羅華榮，甘梅富，徐鋮，徐偉銘，梁勇

（1.溫州醫(yī)科大學 第一臨床醫(yī)學院，浙江 溫州 325035；2.臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院 病理科，浙江 臺州 318050；3.臺州學院 醫(yī)學院，浙江 臺州 318000）

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率逐年上升，已躍居女性常見腫瘤的第5位[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺最常見的惡性腫瘤，受環(huán)境、遺傳和激素等多種因素的影響，并與慢性淋巴細胞性甲狀腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）明顯相關。程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）是重要的負性免疫調節(jié)分子，能夠抑制T淋巴細胞的功能，是導致腫瘤發(fā)生免疫逃逸的重要原因之一[2]。目前關于PD-L1蛋白在甲狀腺疾病中的研究較少，尚處于初始的探索階段。BRAF V600E基因突變是PTC最常見的分子事件，在PTC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[3]。本研究通過檢測PTC組織中PD-L1蛋白的表達，探討其與PTC臨床病理特征及BRAF V600E基因突變的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩醫(yī)院病理科2017年1月至12月間手術切除原發(fā)性PTC連續(xù)標本74例。其中男21例，女53例，年齡17～72歲，平均（47±12）歲。根據(jù)AJCC第8版甲狀腺癌分期標準[4]，以55歲作為診斷年齡切點，＜55歲57例，≥55歲17例；I期59例，II期10例，III～IV期5例。按2004年WHO頒布的PTC分類分為經(jīng)典型66例，濾泡亞型8例。腫瘤直徑≤2 cm 50例，＞2 cm且≤4 cm 20例，＞4 cm 4例。甲狀腺外浸潤55例，未浸潤19例。淋巴結轉移40例，未轉移34例。35例伴有CLT（CLT），39例不伴有CLT（Non-CLT）。選取甲狀腺癌組織邊緣＞2 cm或對側正常甲狀腺組織作癌旁對照組。所有標本的患者術前均未接受治療。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體PD-L1（SP142）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，EnVision檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自丹麥Dako公司，人類BRAF V600E基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 方法 所有手術標本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下評估腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）情況。PD-L1檢測采用免疫組織化學Envision兩步法，以PBS代替一抗作為陰性對照，高溫高壓抗原修復，DAB顯色。BRAF V600E基因檢測采用Q-PCR法，操作步驟嚴格按照試劑說明書進行，石蠟組織提取DNA，樣本DNA評估設有陽性質控品和陰性質控品（純化水）。分析儀器：ABI 7500（Applied Biosystems，美國應用生物系統(tǒng)公司）。

1.4 結果判定 參照乳腺癌TILs評估標準[5]，以單核炎癥細胞占腫瘤間質面積的平均百分比評估：TILs占腫瘤間質≥10%為TILs-rich，TILs占腫瘤間質＜10%為TILs-poor。PD-L1蛋白陽性診斷標準[6]：＞5%的腫瘤細胞有明確的細胞膜或/和細胞質著色。BRAF V600E基因突變的判定：樣本FAM信號Ct值＜28為陽性，樣本FAM信號Ct值≥28或低于試劑盒的檢測下限為陰性。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。單因素比較采用χ2檢驗，采用多因素logistic回歸模型評估影響PD-L1蛋白表達的臨床病理因素，采用Kappa一致性檢驗評判PD-L1蛋白表達和BRAF V600E基因突變的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1蛋白的表達 PD-L1蛋白在PTC組織中的陽性表達率為48.6%（36/74），以腫瘤細胞的灶性表達為主，主要表現(xiàn)為細胞膜和（或）細胞質強弱不等的棕黃色著色；對照組PD-L1蛋白的表達率為0（0/74）。PTC組與對照組的PD-L1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=47.571，P＜0.001）。見圖1。

圖1 PD-L1蛋白在PTC組織中的表達

2.2 PD-L1蛋白表達與PTC臨床病理特征的關系 PDL1蛋白在不同年齡、腫瘤大小、TILs豐富程度、CLT背景及臨床分期組別中的表達差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PD-L1蛋白在不同性別、不同組織學類型、有無腺外浸潤及有無淋巴結轉移組別中的表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 BRAF V600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系 74例PTC中BRAF V600E基因突變的陽性率為79.7%（59/74）。對照組中BRAF V600E基因突變的陽性率為0（0/74）。差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。BRAF V600E基因突變與PTC的組織學分型有關（P＜0.01）；BRAF V600E基因突變在不同性別、年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、有無腺外浸潤、有無淋巴結轉移及臨床分期組別中的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 PD-L1蛋白表達與PTC臨床病理參數(shù)的關系（例）

2.4 PTC組織中PD-L1蛋白表達和BRAF V600E基因突變的相關性 在PD-L1蛋白陽性表達的PTC組織中BRAF V600E基因突變率為75.0%（27/36），在PD-L1蛋白陰性表達的PTC組織中BRAF V600E基因突變率為84.2%（32/38）。Kappa檢驗統(tǒng)計分析表明，在PTC組織中，PD-L1蛋白表達和BRAF V600E基因突變之間缺少一致性（Kappa=-0.091，P=0.325）。

表2 BRAF V600E基因突變與PTC臨床病理參數(shù)的關系（例）

2.5 PD-L1蛋白表達的影響因素 取年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、臨床分期為自變量，以PD-L1蛋白表達為應變量，采用進入法做logistic回歸分析，結果顯示CLT背景是影響PD-L1蛋白表達的獨立因素（OR=18.675，95%CI：3.074～113.453，P＜0.01）。見表3。

3 討論

PD-L1又稱B7同源分子1（B7 homologue 1，B7-H1），是程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）的配體。PD-L1基因定位于人染色體的9p24，編碼含有290個氨基酸的I型跨膜蛋白。PD-L1蛋白和PD-1結合后，由PD-1傳遞抑制性信號，調控淋巴細胞功能，誘導機體產(chǎn)生免疫抑制。此外，PD-1還可抑制炎性介質的釋放，影響T細胞的分化，促進調節(jié)性T細胞的生成。PD-1/PD-L1通路參與了腫瘤的免疫應答調控，在腫瘤免疫耐受的建立及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來，以PD-L1為靶點的免疫檢查點阻斷療法已廣泛應用于多種腫瘤的臨床治療[7]。研究表明，PD-L1可以在多種腫瘤細胞中誘導表達，如惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌、腎癌等[8]。PDL1蛋白在PTC中也有表達，但目前相關的研究仍然較少。CHOWDHURY等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在66.5%的PTC病例中呈細胞質陽性表達，40.0%的病例呈細胞膜陽性表達。本研究結果顯示，PD-L1蛋白在PTC組織中的陽性表達率為48.6%，陽性部位主要定位在腫瘤細胞的細胞膜或/和細胞質上，PD-L1蛋白在PTC組與對照組中的表達差異顯著（P＜0.01），這與上述研究結果一致。

表3 PD-L1蛋白表達影響因素logistic回歸分析

至少有1/3的PTC組織中伴有CLT。HAYASHI等[10]發(fā)現(xiàn)，PD-L1基因的單核苷酸多態(tài)性在Graves病的發(fā)展過程中起著重要的作用。而Graves病的組織學主要表現(xiàn)就是CLT。本組結果顯示，PTC組織中CLT的比例達到47.3%（35/74），CLT組與Non-CLT組間的PD-L1蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義，且CLT背景是影響PD-L1蛋白表達的獨立因素?？梢酝茰y，CLT與PD-L1蛋白之間可能存在著相同的信號通路，CLT可能是影響抗PD-L1免疫治療的重要因素。這有待于進一步的研究證實。隨著免疫檢查點阻斷療法在腫瘤患者中的應用，研究者們發(fā)現(xiàn)抗PD-L1免疫治療只對某種腫瘤的一部分患者有效[11]。這種差異不僅和腫瘤中PD-L1蛋白表達有關，而且也和TILs的表達水平有關。這就要求我們必須根據(jù)PD-L1蛋白的和TILs的表達水平對不同病例采取個性化的免疫治療方法[12]。本研究顯示PD-L1蛋白在PTC組織中的表達隨著TILs的遞增而遞增，證實了PD-L1蛋白的陽性表達與TILs的豐富程度有關。這與BAI等[6]的研究結果一致。此外，越來越多的研究認為，PDL1蛋白表達可以作為判斷PTC預后的重要指標，PDL1蛋白表達陽性預示著更大的復發(fā)風險和更短的無病生存期[9]。眾所周知，PTC的診斷年齡是PTC預后的獨立危險因素[13-14]。本研究結果顯示，高年齡組的PD-L1陽性率高于低年齡組，PD-L1蛋白的表達與腫瘤大小及臨床分期有關，證實了PD-L1蛋白的陽性表達可能與PTC的侵襲性特征和不良預后有關。

BRAF V600E基因突變是PTC最常見的基因突變，對PTC的診斷、鑒別診斷及預后判斷均有重要價值[15]。BRAF V600E基因定位于人染色體7q34，編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK激酶家族中最高效的磷酸化劑。目前能檢測到的BRAF V600E基因突變已經(jīng)超過30種，其中T1799A點突變是最常見的BRAF V600E激活突變[16]。研究結果表明，不同國家PTC組織中的BRAF V600E基因突變檢出率不同，歐美國家BRAF V600E突變率低于亞洲國家，說明BRAF V600E基因突變可能存在種族差異。XING等[3]總結了1856例PTC檢測結果，發(fā)現(xiàn)BRAF V600E的突變率為44%。本研究BRAF V600E基因突變的陽性率為79.7%，與亞洲國家的檢出率相仿[6]。研究表明，BRAF V600E基因突變是PTC預后不良的指標[15]。本組結果顯示，BRAF V600E基因突變率在不同性別、年齡、腫瘤大小、CLT背景、TILs豐富程度、腺外浸潤、淋巴結轉移及臨床分期中的組間差異均無統(tǒng)計學意義，這可能與入組的中晚期患者過少有關，有待后續(xù)更大樣本的研究。本組BRAF V600E基因突變與PTC的經(jīng)典型組織學類型有關，與文獻[3]相符。ANGELL等[17]發(fā)現(xiàn)伴有BRAF V600E基因突變的PTC與PD-L1蛋白表達增高密切相關。而BAI等[6]通過免疫組織化學染色分析了126例PTC病例，結果顯示BRAF V600E的陽性表達與PD-L1蛋白的表達沒有相關性，這與BASTMAN等[18]的研究結果一致。本研究通過Kappa檢驗分析，并未發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達與BRAF V600E基因突變存在相關性。

綜上所述，PD-L1作為一種新的分子標記物，有望成為PTC侵襲性特征的指標，其表達與PTC的臨床病理特征有關?，F(xiàn)階段對于PD-L1蛋白表達與BRAF V600E基因突變的報道各異，可能與BRAF V600E基因突變在不同人種中的表達差異有關；同時，目前免疫組織化學檢測PD-L1尚無統(tǒng)一的陽性標準，不同克隆號抗體的陽性截點不同，也導致了統(tǒng)計結果之間的差異。因此，對于PD-L1蛋白表達與BRAF V600E基因突變的相關性，仍需更深入的研究分析。