胡磊

（金華市中心醫(yī)院 急診科，浙江 金華 321000）

所有健康血管內皮細胞表面均覆蓋有多糖-蛋白質復合物，這種復合物可調節(jié)內皮細胞通透性、保持內皮細胞屏障功能以及抑制血管內血栓形成等[1]。嚴重創(chuàng)傷或出血性休克可導致血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物降解，從而導致血液凝固、細胞炎癥反應和內皮細胞屏障功能失調，這種損傷稱為“創(chuàng)傷性血管內皮細胞病”，其致病機制尚不明確[2]。氨甲環(huán)酸（tranexamic acid，TXA）已被廣泛應用于臨床創(chuàng)傷治療中，但確切作用機制仍不十分明確[3]。近年來研究表明，在出血性休克致腸上皮細胞損傷模型中，TXA腔內給藥可通過保護上皮細胞多糖-蛋白質復合物而發(fā)揮上皮細胞保護作用[4]，但TXA對創(chuàng)傷導致體外血管內皮細胞中細胞多糖-蛋白質復合物的作用尚未見報道。為此，本研究探討TXA在不同時間點給藥對體外血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自上海細胞生物研究所；DMEM低糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Hoechst 33258購自美國Sigma公司；cleaved-caspase-3抗體購自上海碧云天生物科技有限公司；細胞間黏附分子（in-tercellular cell adhesion molecule，ICAM）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；多配體聚糖、透明質酸（hyaluronic acid，HLA）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）含量檢測的ELISA試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室和Matrigel膠購自美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和細胞分組 將HUVECs接種于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉。細胞置于37 ℃下5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內，當細胞生長至鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%～90%以上時用適量胰蛋白酶消化傳代，實驗選用第3～第5代細胞進行實驗。調整細胞濃度為1×106/L，將200 μL細胞懸液接種于96孔板中，隨機分為正常對照組、H2O2組、H2O2+TXA（30 min）組、H2O2+TXA（60 min）組、H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組，后5組細胞均加入100 μmol/L的H2O2作用12 h，并分別在H2O2作用開始后30 min和60 min以及H2O2作用結束前1 h和2 h這4個時間點加入TXA（150 μmol/L）作用1 h。

1.3 細胞形態(tài)學觀察 調整細胞濃度為1×106/L，取細胞懸液0.5 mL于載玻片上，加入濃度為10 μg/mL的Hoechst 33258液10 μL，在室溫下避光處理10 min，立即在Olympus倒置熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。每組重復3次，每次重復計數(shù)50個細胞。

1.4 Western blot檢測蛋白表達 將細胞置于冰PBS液中洗滌3次，添加細胞裂解液后置于冰上反應30 min，在12000 r/min的速度下冷凍離心20 min，收集上清液后應用BCA法定量蛋白。每份樣品使用30 μg蛋白質，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜上，在4 ℃溫度下使用5%脫脂奶粉反應過夜，硝酸纖維素膜經一抗和二抗反應后進行ECL顯色、曝光和顯影，利用灰度分析軟件半定量計算目的蛋白表達量，以β-actin為內參。

1.5 ELISA法檢測多配體聚糖、HLA和TNF-α含量調整細胞濃度為1×106/L，取1 mL細胞懸液接種于24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細胞鋪滿底面積進行細胞功能性實驗，實驗結束后即刻收集細胞上清液，在12000 r/min的速度下常溫離心20 min，將細胞上清液收集于EP管中，并凍存于-20 ℃冰箱備用。臨實驗時取出EP管，迅速復溶后嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作，在酶標儀450 nm處讀取吸光度值，并按照各自標準繪制標準曲線，分別計算多配體聚糖、HLA和TNF-α含量值。

1.6 細胞體外侵襲實驗 將消化后的細胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基中，調整細胞濃度為1×104/mL，將300 μL細胞懸液和300 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基分別加入Transwell上室和下室，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加結晶紫染色液進行染色，維持染色時間20 min，用PBS液清洗3遍后將Transwell上室放置在倒置顯微鏡下進行觀察，在高倍鏡下隨機選取10個視野對穿過小室的藍染細胞進行計數(shù)，計算藍染細胞平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，各組間比較用單因素方差分析，組內比較用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TXA對HUVECs凋亡的影響 熒光顯微鏡下觀察到正常對照組細胞核呈均勻的低強度熒光，H2O2組細胞可見大量細胞出現(xiàn)染色體邊集呈新月狀，同時出現(xiàn)凋亡小體，呈典型凋亡細胞改變，細胞凋亡率明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與H2O2組相比，H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組凋亡細胞均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組細胞凋亡率與H2O2組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1和表1。與正常對照組比，H2O2組HUVECs后可顯著上調cleaved-caspase-3蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中cleaved-caspase-3的表達較H2O2組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；cleaved-caspase-3蛋白在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達與H2O2組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察HUVECs凋亡，箭頭示典型凋亡細胞（Hoechst 33258熒光染色法，×400）

表1 TXA對HUVECs凋亡的保護作用

圖2 TXA對HUVECs中cleaved-caspase-3蛋白表達的影響

2.2 TXA對HUVECs中的ICAM和MMP-9蛋白表達的影響與正常對照組比，H2O2組的HUVECs中ICAM和MMP-9蛋白表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與H2O2組比，H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中ICAM和MMP-9的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中ICAM和MMP-9蛋白的表達與H2O2組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.3 TXA對HUVECs中的多配體聚糖表達的影響 與正常對照組比，H2O2組HUVECs的多配體聚糖的表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（24.7±5.1vs.78.6±11.6，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中多配體聚糖的表達分別為（27.6±5.3）ng/mL和（28.7±4.5）ng/mL，與H2O2組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而多配體聚糖在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達與H2O2組比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖3 TXA對HUVECs中ICAM和MMP-9蛋白表達的影響

圖4 TXA對體外HUVECs中多配體聚糖表達的影響

2.4 TXA對HUVECs中的HLA和TNF-α表達的影響H2O2組HUVECs的HLA表達顯著上調，與正常對照組比，差異有統(tǒng)計學意義（17.8±3.3vs.64.2±11.4，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中HLA的表達分別為（22.8±5.3）ng/mL和（25.1±5.7）ng/mL，與H2O2組比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而HLA在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達與H2O2組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。與正常對照組比，H2O2組HUVECs中TNF-α的表達可明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（16.3±2.7vs.74.9±15.4，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中TNF-α的表達分別為（28.5±4.8）pg/mL和（33.8±4.1）pg/mL，與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中TNF-α的表達，與H2O2組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖5 TXA對體外HUVECs中HLA表達的影響

圖6 TXA對體外HUVECs中TNF-α表達的影響

2.5 TXA對體外HUVECs侵襲的影響 H2O2組HUVECs侵襲性行為顯著升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（2.3±0.3vs.32.8±6.2，P＜0.01）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組侵襲細胞數(shù)分別為（7.6±1.2）和（8.7±1.5），與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中侵襲出Matrigel膠的細胞數(shù)為（14.8±4.7）和（16.2±4.3），與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖7。

3 討論

內皮細胞多糖-蛋白質復合物作為內皮細胞膜的骨架在維持血管通透性中發(fā)揮了重要的屏障作用，同時還具有將細胞外信號傳遞至細胞內的功能。多糖-蛋白質復合物的主要成分為葡糖氨基葡聚糖和蛋白聚糖，葡糖氨基葡聚糖主要有硫酸乙酰肝素、HLA和硫酸軟骨素，而蛋白聚糖多由多配體聚糖和糖蛋白組成[5-6]。由于多糖-蛋白質復合物難以在體內環(huán)境中觀察到，因此檢測多配體聚糖和HLA的含量可間接反映多糖-蛋白質復合物的降解。研究表明，活性氧及炎癥因子可破壞內皮細胞多糖-蛋白質復合物，同時創(chuàng)傷相關的交感神經活化可特異性降解血管內皮細胞中的多糖-蛋白質復合物，并引起凝血功能障礙，從而表明多糖-蛋白質復合物可能參與機體凝血過程。

圖7 Transwell小室實驗檢測TXA在不同時機給藥對體外HUVECs侵襲行為的作用（結晶紫染色法，×400）

血管內皮細胞作為血液和組織間的屏障組織，在調節(jié)血液信號轉導、炎癥反應和血液凝固等生理活動中發(fā)揮了重要作用。既往研究表明諸如膿毒血癥和出血性休克等急危重癥可對血管內皮細胞產生抑制作用。H2O2作為一種強氧化劑，可調控細胞氧化信號通路，同時H2O2可導致血管內皮細胞多層面損傷，并破壞血管內皮細胞多糖-蛋白質復合物完整性[7]。在本研究中所使用的H2O2濃度為100 μmol/L，并將H2O2作用于體外培養(yǎng)HUVECs，首先觀察到H2O2作用后可誘導大量內皮細胞凋亡，從而在細胞凋亡層面觀察到H2O2對內皮細胞的損傷。ICAM作為存在于內皮細胞中黏附分子免疫球蛋白超家族，在TNF-α等炎癥因子刺激下表達上調，從而在介導細胞炎癥反應中發(fā)揮了重要作用，研究表明ICAM 與內皮細胞激活和屏障功能密切相關[8-9]。本研究也觀察到H2O2作用后可明顯上調ICAM和TNF-α的表達，從而表明H2O2可引起顯著的內皮細胞激活和損傷。

內皮細胞多糖-復合物可作為創(chuàng)傷性休克引起內皮細胞屏障損傷的早期標志。研究表明內皮細胞中多配體聚糖和HLA的流失與內皮細胞多糖-蛋白質復合物的降解關系密切；同時內皮細胞性多糖-蛋白質復合體在嚴重創(chuàng)傷患者中往往表達下調，并與血管通透性和急性創(chuàng)傷性凝血功能障礙密切相關[10]。因此，改善或者逆轉血管內皮細胞多糖-蛋白質復合物在嚴重創(chuàng)傷患者的降解過程有望降低病死率，并改善預后。BUTWICK等[11]報道將新鮮冰凍血漿輸注至出血性休克患者體內可減少多配體聚糖的降解，從而緩解患者炎癥反應及病情進展；DUEBEL等[12]稱凝血酶原復合物因子IV也具有新鮮冰凍血漿類似的功效。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可顯著上調多配體聚糖和HLA在體外血管內皮細胞中表達。有研究表明MMPs家族參與調節(jié)血管壁通透性、血管活性因子生成、血管新生及細胞外基質降解等多種生理活動，而血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物可在炎癥因子的刺激下通過活化包括MMPs在內的細胞外蛋白酶而發(fā)生降解[13-14]。本研究觀察到H2O2作用可導致內皮細胞中MMP-9表達上調，并促進體外血管內皮細胞侵襲。至此，本研究通過將H2O2作用于體外血管內皮細胞，觀察到H2O2可通過促進血管內皮細胞中炎癥因子和細胞外蛋白酶的表達，從而促進多配體聚糖和HLA的表達，表明H2O2可破壞血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物，與既往文獻[15]報道相吻合。

TXA是一種廣泛應用于臨床的凝血藥。研究發(fā)現(xiàn)在出血性創(chuàng)傷發(fā)生后的3 h內使用TXA可有效減少出血引起的病死率[16]；同時一項軍方研究表明在急性創(chuàng)傷發(fā)生后1 h內使用TXA可顯著降低患者病死率[17]。上述研究使TXA在急性創(chuàng)傷患者中廣泛使用，尤其是在院前急救過程中，其作用機制與其抗纖維蛋白溶解作用相關，但這并不能解釋TXA在創(chuàng)傷患者治療中的所有治療效果。在進一步研究TXA的作用機制中發(fā)現(xiàn)，TXA可緩解手術創(chuàng)傷患者的炎癥反應；同時在嚴重創(chuàng)傷患者中單獨使用TXA可有效降低多器官衰竭和病死率，從而表明出血性創(chuàng)傷患者從TXA中獲益并非只是其止血作用。近來一項針對嚙齒動物休克模型的研究表明，TXA腔內注射可保護動物腸黏膜屏障的自身消化作用；同時腔內注射TXA還可抑制缺血/再灌注損傷引起的的腸壁通透性增加，并對實驗動物肺功能發(fā)揮保護作用，其作用機制與TXA抑制解聚素、金屬蛋白酶和腫瘤壞死因子的表達相關[10-11]。本研究將TXA在不同時間點作用于體外血管內皮細胞中發(fā)現(xiàn)，早期TXA給藥可抑制H2O2對內皮細胞的凋亡誘導和侵襲性增強的作用，同時可抑制H2O2對血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物的破壞作用，而晚期給藥則對內皮細胞損傷無明顯保護作用，提示臨床應用TXA需早期給藥，而血管內皮細胞中多糖-蛋白質復合物也有望成為創(chuàng)傷性休克患者有效作用靶點。