胡磊

（金華市中心醫(yī)院 急診科，浙江 金華 321000）

所有健康血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均覆蓋有多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞通透性、保持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能以及抑制血管內(nèi)血栓形成等[1]。嚴(yán)重創(chuàng)傷或出血性休克可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物降解，從而導(dǎo)致血液凝固、細(xì)胞炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能失調(diào)，這種損傷稱為“創(chuàng)傷性血管內(nèi)皮細(xì)胞病”，其致病機(jī)制尚不明確[2]。氨甲環(huán)酸（tranexamic acid，TXA）已被廣泛應(yīng)用于臨床創(chuàng)傷治療中，但確切作用機(jī)制仍不十分明確[3]。近年來(lái)研究表明，在出血性休克致腸上皮細(xì)胞損傷模型中，TXA腔內(nèi)給藥可通過(guò)保護(hù)上皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物而發(fā)揮上皮細(xì)胞保護(hù)作用[4]，但TXA對(duì)創(chuàng)傷導(dǎo)致體外血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究探討TXA在不同時(shí)間點(diǎn)給藥對(duì)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Hoechst 33258購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；cleaved-caspase-3抗體購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞間黏附分子（in-tercellular cell adhesion molecule，ICAM）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；多配體聚糖、透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HLA）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）含量檢測(cè)的ELISA試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室和Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞分組 將HUVECs接種于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉。細(xì)胞置于37 ℃下5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%～90%以上時(shí)用適量胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用第3～第5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，將200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、H2O2組、H2O2+TXA（30 min）組、H2O2+TXA（60 min）組、H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組，后5組細(xì)胞均加入100 μmol/L的H2O2作用12 h，并分別在H2O2作用開(kāi)始后30 min和60 min以及H2O2作用結(jié)束前1 h和2 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入TXA（150 μmol/L）作用1 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，取細(xì)胞懸液0.5 mL于載玻片上，加入濃度為10 μg/mL的Hoechst 33258液10 μL，在室溫下避光處理10 min，立即在Olympus倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。每組重復(fù)3次，每次重復(fù)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞置于冰PBS液中洗滌3次，添加細(xì)胞裂解液后置于冰上反應(yīng)30 min，在12000 r/min的速度下冷凍離心20 min，收集上清液后應(yīng)用BCA法定量蛋白。每份樣品使用30 μg蛋白質(zhì)，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在4 ℃溫度下使用5%脫脂奶粉反應(yīng)過(guò)夜，硝酸纖維素膜經(jīng)一抗和二抗反應(yīng)后進(jìn)行ECL顯色、曝光和顯影，利用灰度分析軟件半定量計(jì)算目的蛋白表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參。

1.5 ELISA法檢測(cè)多配體聚糖、HLA和TNF-α含量調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，取1 mL細(xì)胞懸液接種于24孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞鋪滿底面積進(jìn)行細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻收集細(xì)胞上清液，在12000 r/min的速度下常溫離心20 min，將細(xì)胞上清液收集于EP管中，并凍存于-20 ℃冰箱備用。臨實(shí)驗(yàn)時(shí)取出EP管，迅速?gòu)?fù)溶后嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值，并按照各自標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算多配體聚糖、HLA和TNF-α含量值。

1.6 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將消化后的細(xì)胞加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，將300 μL細(xì)胞懸液和300 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基分別加入Transwell上室和下室，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后添加結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色，維持染色時(shí)間20 min，用PBS液清洗3遍后將Transwell上室放置在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，在高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野對(duì)穿過(guò)小室的藍(lán)染細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TXA對(duì)HUVECs凋亡的影響 熒光顯微鏡下觀察到正常對(duì)照組細(xì)胞核呈均勻的低強(qiáng)度熒光，H2O2組細(xì)胞可見(jiàn)大量細(xì)胞出現(xiàn)染色體邊集呈新月?tīng)?，同時(shí)出現(xiàn)凋亡小體，呈典型凋亡細(xì)胞改變，細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與H2O2組相比，H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組凋亡細(xì)胞均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組細(xì)胞凋亡率與H2O2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1和表1。與正常對(duì)照組比，H2O2組HUVECs后可顯著上調(diào)cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中cleaved-caspase-3的表達(dá)較H2O2組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；cleaved-caspase-3蛋白在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達(dá)與H2O2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察HUVECs凋亡，箭頭示典型凋亡細(xì)胞（Hoechst 33258熒光染色法，×400）

表1 TXA對(duì)HUVECs凋亡的保護(hù)作用

圖2 TXA對(duì)HUVECs中cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.2 TXA對(duì)HUVECs中的ICAM和MMP-9蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比，H2O2組的HUVECs中ICAM和MMP-9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H2O2組比，H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中ICAM和MMP-9的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中ICAM和MMP-9蛋白的表達(dá)與H2O2組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

2.3 TXA對(duì)HUVECs中的多配體聚糖表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比，H2O2組HUVECs的多配體聚糖的表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24.7±5.1vs.78.6±11.6，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中多配體聚糖的表達(dá)分別為（27.6±5.3）ng/mL和（28.7±4.5）ng/mL，與H2O2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而多配體聚糖在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達(dá)與H2O2組比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 TXA對(duì)HUVECs中ICAM和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

圖4 TXA對(duì)體外HUVECs中多配體聚糖表達(dá)的影響

2.4 TXA對(duì)HUVECs中的HLA和TNF-α表達(dá)的影響H2O2組HUVECs的HLA表達(dá)顯著上調(diào)，與正常對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（17.8±3.3vs.64.2±11.4，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中HLA的表達(dá)分別為（22.8±5.3）ng/mL和（25.1±5.7）ng/mL，與H2O2組比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而HLA在H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中的表達(dá)與H2O2組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組比，H2O2組HUVECs中TNF-α的表達(dá)可明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（16.3±2.7vs.74.9±15.4，P＜0.05）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組中TNF-α的表達(dá)分別為（28.5±4.8）pg/mL和（33.8±4.1）pg/mL，與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中TNF-α的表達(dá)，與H2O2組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖6。

圖5 TXA對(duì)體外HUVECs中HLA表達(dá)的影響

圖6 TXA對(duì)體外HUVECs中TNF-α表達(dá)的影響

2.5 TXA對(duì)體外HUVECs侵襲的影響 H2O2組HUVECs侵襲性行為顯著升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2.3±0.3vs.32.8±6.2，P＜0.01）；H2O2+TXA（30 min）組和H2O2+TXA（60 min）組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（7.6±1.2）和（8.7±1.5），與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而H2O2+TXA（10 h）組和H2O2+TXA（11 h）組中侵襲出Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)為（14.8±4.7）和（16.2±4.3），與H2O2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物作為內(nèi)皮細(xì)胞膜的骨架在維持血管通透性中發(fā)揮了重要的屏障作用，同時(shí)還具有將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)的功能。多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的主要成分為葡糖氨基葡聚糖和蛋白聚糖，葡糖氨基葡聚糖主要有硫酸乙酰肝素、HLA和硫酸軟骨素，而蛋白聚糖多由多配體聚糖和糖蛋白組成[5-6]。由于多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物難以在體內(nèi)環(huán)境中觀察到，因此檢測(cè)多配體聚糖和HLA的含量可間接反映多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解。研究表明，活性氧及炎癥因子可破壞內(nèi)皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，同時(shí)創(chuàng)傷相關(guān)的交感神經(jīng)活化可特異性降解血管內(nèi)皮細(xì)胞中的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并引起凝血功能障礙，從而表明多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物可能參與機(jī)體凝血過(guò)程。

圖7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TXA在不同時(shí)機(jī)給藥對(duì)體外HUVECs侵襲行為的作用（結(jié)晶紫染色法，×400）

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液和組織間的屏障組織，在調(diào)節(jié)血液信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和血液凝固等生理活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。既往研究表明諸如膿毒血癥和出血性休克等急危重癥可對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。H2O2作為一種強(qiáng)氧化劑，可調(diào)控細(xì)胞氧化信號(hào)通路，同時(shí)H2O2可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞多層面損傷，并破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物完整性[7]。在本研究中所使用的H2O2濃度為100 μmol/L，并將H2O2作用于體外培養(yǎng)HUVECs，首先觀察到H2O2作用后可誘導(dǎo)大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而在細(xì)胞凋亡層面觀察到H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。ICAM作為存在于內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子免疫球蛋白超家族，在TNF-α等炎癥因子刺激下表達(dá)上調(diào)，從而在介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，研究表明ICAM 與內(nèi)皮細(xì)胞激活和屏障功能密切相關(guān)[8-9]。本研究也觀察到H2O2作用后可明顯上調(diào)ICAM和TNF-α的表達(dá)，從而表明H2O2可引起顯著的內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷。

內(nèi)皮細(xì)胞多糖-復(fù)合物可作為創(chuàng)傷性休克引起內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷的早期標(biāo)志。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞中多配體聚糖和HLA的流失與內(nèi)皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的降解關(guān)系密切；同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞性多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合體在嚴(yán)重創(chuàng)傷患者中往往表達(dá)下調(diào)，并與血管通透性和急性創(chuàng)傷性凝血功能障礙密切相關(guān)[10]。因此，改善或者逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物在嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的降解過(guò)程有望降低病死率，并改善預(yù)后。BUTWICK等[11]報(bào)道將新鮮冰凍血漿輸注至出血性休克患者體內(nèi)可減少多配體聚糖的降解，從而緩解患者炎癥反應(yīng)及病情進(jìn)展；DUEBEL等[12]稱凝血酶原復(fù)合物因子IV也具有新鮮冰凍血漿類似的功效。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2可顯著上調(diào)多配體聚糖和HLA在體外血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。有研究表明MMPs家族參與調(diào)節(jié)血管壁通透性、血管活性因子生成、血管新生及細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種生理活動(dòng)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物可在炎癥因子的刺激下通過(guò)活化包括MMPs在內(nèi)的細(xì)胞外蛋白酶而發(fā)生降解[13-14]。本研究觀察到H2O2作用可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲。至此，本研究通過(guò)將H2O2作用于體外血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察到H2O2可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥因子和細(xì)胞外蛋白酶的表達(dá)，從而促進(jìn)多配體聚糖和HLA的表達(dá)，表明H2O2可破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物，與既往文獻(xiàn)[15]報(bào)道相吻合。

TXA是一種廣泛應(yīng)用于臨床的凝血藥。研究發(fā)現(xiàn)在出血性創(chuàng)傷發(fā)生后的3 h內(nèi)使用TXA可有效減少出血引起的病死率[16]；同時(shí)一項(xiàng)軍方研究表明在急性創(chuàng)傷發(fā)生后1 h內(nèi)使用TXA可顯著降低患者病死率[17]。上述研究使TXA在急性創(chuàng)傷患者中廣泛使用，尤其是在院前急救過(guò)程中，其作用機(jī)制與其抗纖維蛋白溶解作用相關(guān)，但這并不能解釋TXA在創(chuàng)傷患者治療中的所有治療效果。在進(jìn)一步研究TXA的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，TXA可緩解手術(shù)創(chuàng)傷患者的炎癥反應(yīng)；同時(shí)在嚴(yán)重創(chuàng)傷患者中單獨(dú)使用TXA可有效降低多器官衰竭和病死率，從而表明出血性創(chuàng)傷患者從TXA中獲益并非只是其止血作用。近來(lái)一項(xiàng)針對(duì)嚙齒動(dòng)物休克模型的研究表明，TXA腔內(nèi)注射可保護(hù)動(dòng)物腸黏膜屏障的自身消化作用；同時(shí)腔內(nèi)注射TXA還可抑制缺血/再灌注損傷引起的的腸壁通透性增加，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制與TXA抑制解聚素、金屬蛋白酶和腫瘤壞死因子的表達(dá)相關(guān)[10-11]。本研究將TXA在不同時(shí)間點(diǎn)作用于體外血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，早期TXA給藥可抑制H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)和侵襲性增強(qiáng)的作用，同時(shí)可抑制H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物的破壞作用，而晚期給藥則對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷無(wú)明顯保護(hù)作用，提示臨床應(yīng)用TXA需早期給藥，而血管內(nèi)皮細(xì)胞中多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物也有望成為創(chuàng)傷性休克患者有效作用靶點(diǎn)。