顏林志,曹丹,王樂(lè)丹,李文桔,呂杰強(qiáng)
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,浙江 溫州 325027)
子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女常見(jiàn)的一種良性疾病,但是它的一些生物學(xué)行為和惡性腫瘤相類(lèi)似。近年來(lái),腫瘤靶向治療是腫瘤臨床治療的熱點(diǎn)之一,而在子宮內(nèi)膜異位癥的治療中尚沒(méi)有特異性的藥物能到達(dá)病灶局部并形成有效的殺傷濃度,因此子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療將成為解決這一問(wèn)題的重要手段。噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是篩選腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的一種生物學(xué)技術(shù)[1],目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤抗原篩選、單克隆抗體制備等[2-3],為研究子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療提供了新的方法。本研究在噬菌體展示基礎(chǔ)上,以子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜為靶標(biāo),通過(guò)噬菌體展示的隨機(jī)7肽庫(kù)篩選子宮內(nèi)膜異位癥特異性結(jié)合多肽,鑒定篩選的陽(yáng)性噬菌體的親和性及特異性,并分析這些多肽的氨基酸序列,為研究多肽在子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷和治療方面提供研究資料。
1.1 材料
1.1.1 試劑:噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司,文庫(kù)滴度為2×1013pfu/mL,隨機(jī)多樣性為1.28×109,大腸桿菌ER2738購(gòu)自北京Biovector生物技術(shù)有限公司,HRP-抗M13單抗及M13K07購(gòu)自上海生工生物工程有限公司,鼠抗人細(xì)胞角蛋白19抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司,IV型膠原酶、DNasel及DMEM/F-12購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷購(gòu)自北京益強(qiáng)生科技有限公司。
1.1.2 標(biāo)本:本研究入選2016年1月至6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院的子宮內(nèi)膜異位癥IIIIV期(按美國(guó)AFS分類(lèi))的育齡期女性。共有10位經(jīng)手術(shù)和組織學(xué)確診為子宮內(nèi)膜異位癥的患者入選。所有的在位/異位內(nèi)膜標(biāo)本均在增殖期通過(guò)診斷性刮宮/腹腔鏡下囊腫剔除術(shù)獲得,分為2組:異位內(nèi)膜組(n=10)和在位內(nèi)膜組(n=10,來(lái)自同組的同個(gè)患者),患者在術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)如GnRH-a或性激素等的激素治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞來(lái)源:組織在無(wú)菌條件下獲取后,用乳酸林格液濕潤(rùn),再用PBS液清洗3~5次,立即低溫儲(chǔ)存在液氮中。組織融化后經(jīng)PBS液洗滌2次,剪碎至1 mm3,1 mg/mL的IV型膠原酶于水浴搖床消化1 h,然后加入DNase1(15 U/mL)繼續(xù)消化30 min,消化液分別經(jīng)過(guò)100目和400目篩網(wǎng),濾液4 ℃、800×g離心5 min,沉淀細(xì)胞即為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞再用含15% FBS的DMEM/F-12重懸,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。應(yīng)用玻片法,加鼠抗人細(xì)胞角蛋白19抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的純度。
1.2.2 差減篩選:收集子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,重懸于1% BSA的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/mL。取100 μL在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞,加入噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)10 μL于4 ℃孵育2 h。將細(xì)胞和噬菌體的混懸液加在200 μL鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成的有機(jī)分離液上,10000×g、4 ℃離心10 min。吸出水相里未結(jié)合的噬菌體肽庫(kù)與100 μL異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞于4 ℃孵育3 h離心。取出有機(jī)相內(nèi)沉淀物,其為能與異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的噬菌體,轉(zhuǎn)移沉淀物至新的EP管中,加入200 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ER2738,37 ℃孵育30 min,復(fù)蘇與異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的噬菌體。對(duì)淘洗后的噬菌體進(jìn)行測(cè)滴度、擴(kuò)增、純化,進(jìn)入下一輪差減篩選,計(jì)數(shù)每一輪淘洗和擴(kuò)增后的噬菌體數(shù)目。如此重復(fù)5個(gè)循環(huán),測(cè)定每一輪淘洗和擴(kuò)增后的滴度。
1.2.3 ELISA:經(jīng)過(guò)5輪生物淘洗后,隨機(jī)挑選50個(gè)藍(lán)斑進(jìn)行陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒別,每個(gè)噬菌體克隆一式三份進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞(異位/在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞)以104/孔接種入96孔板,過(guò)夜培養(yǎng),無(wú)血清培養(yǎng)1 h;4%多聚甲醛室溫固定20 min;封閉液封閉2 h;分別加入上述50個(gè)陽(yáng)性噬菌體克?。?010pfu/孔),陰性對(duì)照PBS和M13K07,37 ℃孵育2 h;加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中,室溫孵2 h;最后加入200 μL/孔的TMB顯色液,使用微板閱讀器設(shè)置在450 nm。
1.2.4 DNA測(cè)序和BLAST匹配:經(jīng)過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn),OD450值大于0.5的共有13個(gè)噬菌體克隆被鑒別,提取這些噬菌體DNA,由上海Sangon Biotech有限公司進(jìn)行測(cè)序分析,通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出多肽序列。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST匹配分析。
1.2.5 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn):將異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞以104/孔接種入96孔板,過(guò)夜培養(yǎng)后;無(wú)血清培養(yǎng)1 h;然后用封閉液37 ℃封閉2 h;PBS系列稀釋(0、0.1、1、10、100、1000 nmol/L)合成的多肽RTRLHTR,并與細(xì)胞4 ℃孵育1 h,再與2×1011pfu噬菌體P5于4 ℃繼續(xù)孵育1 h,加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中,室溫孵2 h;最后加入200 μL/孔的TMB顯色液,使用微板閱讀器設(shè)置在450 nm。以肽庫(kù)中無(wú)關(guān)噬菌體編碼的非特異性多肽作為陰性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 差減篩選 本研究經(jīng)過(guò)5輪差減篩選,產(chǎn)出噬菌體的數(shù)量(106pfu/mL)在研究1、2、3、4、5中分別為0.9±0.2,3.3±0.6,8.2±1.2,14.2±1.2及26.9±1.9,兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究5中生物淘洗的濃度是研究1中的30倍。
2.2 ELISA 在實(shí)驗(yàn)中OD450值大于0.5的共有13個(gè)噬菌體克隆被選擇,這13個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆其OD450值分別為0.61±0.05,0.63±0.04,0.56±0.05,0.72±0.06,0.58±0.08,0.65±0.03,0.71±0.03,0.58±0.05,0.59±0.02,0.52±0.04,0.66±0.06,0.77±0.05及0.62±0.04,而對(duì)照組的OD450值為0.07~0.14,與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。
2.3 DNA測(cè)序 經(jīng)過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn),其中OD450值大于0.5的共有13個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的噬菌體克隆被選出(P2,P5,P9,P11,P14,P17,P22,P24,P31,P34,P37,P45,P46),見(jiàn)表1。提取這些噬菌體DNA,由上海Sangon Biotech有限公司進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果顯示13個(gè)噬菌體克隆中包含6個(gè)不同的氨基酸序列,其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCA TACCCGC的噬菌體(P5,P9,P17,P34,P46)被富集,其相應(yīng)的氨基酸序列為RTRLHTR。
圖1 比較選擇的噬菌體克隆在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的不同
2.4 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 預(yù)先用合成多肽RTRLHTR處理后,相應(yīng)噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低。相反,對(duì)照組多肽沒(méi)有顯示這種特異性結(jié)合活性。多肽RTRLHTR在不同濃度(0、0.1、1、10、100及1000 nmol/L)其OD450值分別為0.64±0.04,0.59±0.05,0.54±0.03,0.46±0.05,0.38±0.02及0.29±0.03。多肽RTRLHTR濃度在1000 nmol/L時(shí)能抑制50%的結(jié)合活性。多肽RTRLHTR濃度≥10 nmol/L時(shí),結(jié)合活性與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而多肽RTRLHTR為低濃度(0、0.1、1 nmol/L)時(shí),與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。
表113個(gè)克隆的DNA序列
圖2 不同濃度的合成多肽-噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制表現(xiàn)情況
子宮內(nèi)膜異位癥在形態(tài)學(xué)上呈良性疾病表現(xiàn),但在臨床行為學(xué)上具有與惡性腫瘤類(lèi)似的特點(diǎn)。手術(shù)治療是子宮內(nèi)膜異位癥治療中較為有效的手段[4],然而其有不利的一面,常導(dǎo)致卵巢皮質(zhì)的丟失,卵巢功能的損害,以及較高的復(fù)發(fā)率。藥物治療中GnRH-a是治療子宮內(nèi)膜異位癥的最有效的藥物[5]。然而藥物的作用是暫時(shí)的、保守性的、或是術(shù)前處理用的[6],還伴隨明顯的不良反應(yīng),這些都降低了患者的依從性。究其原因主要是這些激素治療不能選擇性地作用于異位內(nèi)膜細(xì)胞。
腫瘤靶向治療是將高度特異性的親腫瘤物質(zhì)作為載體,使其攜帶抗腫瘤藥物特異性對(duì)腫瘤部位進(jìn)行靶向藥物治療,成為腫瘤治療的新途徑[7-8]。小分子多肽是一種理想的抗腫瘤靶向藥物的載體,其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,容易制備,且對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng),無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[9]。而噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是篩選腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的強(qiáng)有力、高通量的一種生物學(xué)技術(shù),能夠快速篩選出與靶分子親和力高的配體,其最大的優(yōu)勢(shì)即實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合[10]。這為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療提供新的方法。目前以腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo),應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)在體外已成功篩選到能與不同腫瘤細(xì)胞如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌等細(xì)胞表面特異性結(jié)合的多肽[11-12]。國(guó)外也有學(xué)者曾報(bào)道過(guò)子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合肽的篩選[13],國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合多肽的篩選的文獻(xiàn)報(bào)道。
本研究中,在采用噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用體外快速差減篩選技術(shù),篩選特異性結(jié)合到子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的多肽,能有效減少非特異性結(jié)合,提高篩選效率[14]。我們經(jīng)過(guò)5輪的差減篩選,噬菌體濃度從0.9±0.2到26.9±1.9,第5輪中生物淘洗的濃度是第1輪中的30倍,提示結(jié)合的噬菌體被富集了。然后經(jīng)過(guò)5輪差減篩選的50個(gè)藍(lán)斑被隨機(jī)選取,用于ELISA試驗(yàn)及DNA測(cè)序,結(jié)果顯示有13個(gè)噬菌體包含6個(gè)氨基酸序列,其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌體被富集,其相應(yīng)的氨基酸序列為RTRLHTR,這提示了插入序列所編碼的多肽可能具有子宮內(nèi)膜異位癥靶向性的潛能。通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列RTRLHTR最具有潛在研究?jī)r(jià)值,為了驗(yàn)證脫離了噬菌體衣殼蛋白的多肽是否仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞特異親和力,以及多肽與其對(duì)應(yīng)的噬菌體是否競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于同一結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)行了噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)?;瘜W(xué)合成多肽RTRLHTR后進(jìn)行噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明預(yù)先用合成多肽RTRLHTR處理后,相應(yīng)噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低,說(shuō)明脫離了噬菌體的多肽仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞特異親和力,進(jìn)一步表明其為子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞表面的特異性結(jié)合肽。
綜上所述,我們利用噬菌體展示技術(shù)篩選并鑒定了一個(gè)新型多肽序列RTRLHTR,該多肽對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞有高親和力,為藥物靶向傳遞至這些異位內(nèi)膜細(xì)胞提供候選。這個(gè)多肽技術(shù)能被用于連接到包含脂質(zhì)體的激素治療,同樣能改善激素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥治療作用的特異性和有效性,對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)激素治療療效的改善都有一定的作用,既能導(dǎo)致異位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而又沒(méi)有全身的不良反應(yīng)??赡転樽訉m內(nèi)膜異位癥的早期診斷、復(fù)發(fā)及治療提供新的方向,本研究標(biāo)本數(shù)量有限,要進(jìn)一步明確特異性結(jié)合肽與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性并推廣至臨床尚需增大樣本量的研究。另外仍有較多問(wèn)題需要進(jìn)一步的研究,包括親和力的改善,藥代動(dòng)力學(xué)的研究,以及多肽在活體動(dòng)物上干預(yù)的應(yīng)用等。