顏林志，曹丹，王樂(lè)丹，李文桔，呂杰強(qiáng)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女常見(jiàn)的一種良性疾病，但是它的一些生物學(xué)行為和惡性腫瘤相類(lèi)似。近年來(lái)，腫瘤靶向治療是腫瘤臨床治療的熱點(diǎn)之一，而在子宮內(nèi)膜異位癥的治療中尚沒(méi)有特異性的藥物能到達(dá)病灶局部并形成有效的殺傷濃度，因此子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療將成為解決這一問(wèn)題的重要手段。噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是篩選腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的一種生物學(xué)技術(shù)[1]，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤抗原篩選、單克隆抗體制備等[2-3]，為研究子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療提供了新的方法。本研究在噬菌體展示基礎(chǔ)上，以子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜為靶標(biāo)，通過(guò)噬菌體展示的隨機(jī)7肽庫(kù)篩選子宮內(nèi)膜異位癥特異性結(jié)合多肽，鑒定篩選的陽(yáng)性噬菌體的親和性及特異性，并分析這些多肽的氨基酸序列，為研究多肽在子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷和治療方面提供研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司，文庫(kù)滴度為2×1013pfu/mL，隨機(jī)多樣性為1.28×109，大腸桿菌ER2738購(gòu)自北京Biovector生物技術(shù)有限公司，HRP-抗M13單抗及M13K07購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，鼠抗人細(xì)胞角蛋白19抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，IV型膠原酶、DNasel及DMEM/F-12購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷購(gòu)自北京益強(qiáng)生科技有限公司。

1.1.2 標(biāo)本：本研究入選2016年1月至6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院的子宮內(nèi)膜異位癥IIIIV期（按美國(guó)AFS分類(lèi)）的育齡期女性。共有10位經(jīng)手術(shù)和組織學(xué)確診為子宮內(nèi)膜異位癥的患者入選。所有的在位/異位內(nèi)膜標(biāo)本均在增殖期通過(guò)診斷性刮宮/腹腔鏡下囊腫剔除術(shù)獲得，分為2組：異位內(nèi)膜組（n=10）和在位內(nèi)膜組（n=10，來(lái)自同組的同個(gè)患者），患者在術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)如GnRH-a或性激素等的激素治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞來(lái)源：組織在無(wú)菌條件下獲取后，用乳酸林格液濕潤(rùn)，再用PBS液清洗3～5次，立即低溫儲(chǔ)存在液氮中。組織融化后經(jīng)PBS液洗滌2次，剪碎至1 mm3，1 mg/mL的IV型膠原酶于水浴搖床消化1 h，然后加入DNase1（15 U/mL）繼續(xù)消化30 min，消化液分別經(jīng)過(guò)100目和400目篩網(wǎng)，濾液4 ℃、800×g離心5 min，沉淀細(xì)胞即為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞再用含15% FBS的DMEM/F-12重懸，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。應(yīng)用玻片法，加鼠抗人細(xì)胞角蛋白19抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的純度。

1.2.2 差減篩選：收集子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，重懸于1% BSA的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107/mL。取100 μL在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，加入噬菌體隨機(jī)7肽庫(kù)10 μL于4 ℃孵育2 h。將細(xì)胞和噬菌體的混懸液加在200 μL鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成的有機(jī)分離液上，10000×g、4 ℃離心10 min。吸出水相里未結(jié)合的噬菌體肽庫(kù)與100 μL異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞于4 ℃孵育3 h離心。取出有機(jī)相內(nèi)沉淀物，其為能與異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，轉(zhuǎn)移沉淀物至新的EP管中，加入200 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌ER2738，37 ℃孵育30 min，復(fù)蘇與異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合的噬菌體。對(duì)淘洗后的噬菌體進(jìn)行測(cè)滴度、擴(kuò)增、純化，進(jìn)入下一輪差減篩選，計(jì)數(shù)每一輪淘洗和擴(kuò)增后的噬菌體數(shù)目。如此重復(fù)5個(gè)循環(huán)，測(cè)定每一輪淘洗和擴(kuò)增后的滴度。

1.2.3 ELISA：經(jīng)過(guò)5輪生物淘洗后，隨機(jī)挑選50個(gè)藍(lán)斑進(jìn)行陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒別，每個(gè)噬菌體克隆一式三份進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞（異位/在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞）以104/孔接種入96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)，無(wú)血清培養(yǎng)1 h；4%多聚甲醛室溫固定20 min；封閉液封閉2 h；分別加入上述50個(gè)陽(yáng)性噬菌體克?。?010pfu/孔），陰性對(duì)照PBS和M13K07，37 ℃孵育2 h；加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中，室溫孵2 h；最后加入200 μL/孔的TMB顯色液，使用微板閱讀器設(shè)置在450 nm。

1.2.4 DNA測(cè)序和BLAST匹配：經(jīng)過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)，OD450值大于0.5的共有13個(gè)噬菌體克隆被鑒別，提取這些噬菌體DNA，由上海Sangon Biotech有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出多肽序列。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST匹配分析。

1.2.5 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)：將異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞以104/孔接種入96孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后；無(wú)血清培養(yǎng)1 h；然后用封閉液37 ℃封閉2 h；PBS系列稀釋（0、0.1、1、10、100、1000 nmol/L）合成的多肽RTRLHTR，并與細(xì)胞4 ℃孵育1 h，再與2×1011pfu噬菌體P5于4 ℃繼續(xù)孵育1 h，加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中，室溫孵2 h；最后加入200 μL/孔的TMB顯色液，使用微板閱讀器設(shè)置在450 nm。以肽庫(kù)中無(wú)關(guān)噬菌體編碼的非特異性多肽作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差減篩選 本研究經(jīng)過(guò)5輪差減篩選，產(chǎn)出噬菌體的數(shù)量（106pfu/mL）在研究1、2、3、4、5中分別為0.9±0.2，3.3±0.6，8.2±1.2，14.2±1.2及26.9±1.9，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究5中生物淘洗的濃度是研究1中的30倍。

2.2 ELISA 在實(shí)驗(yàn)中OD450值大于0.5的共有13個(gè)噬菌體克隆被選擇，這13個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆其OD450值分別為0.61±0.05，0.63±0.04，0.56±0.05，0.72±0.06，0.58±0.08，0.65±0.03，0.71±0.03，0.58±0.05，0.59±0.02，0.52±0.04，0.66±0.06，0.77±0.05及0.62±0.04，而對(duì)照組的OD450值為0.07～0.14，與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 DNA測(cè)序 經(jīng)過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)，其中OD450值大于0.5的共有13個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的噬菌體克隆被選出（P2，P5，P9，P11，P14，P17，P22，P24，P31，P34，P37，P45，P46），見(jiàn)表1。提取這些噬菌體DNA，由上海Sangon Biotech有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示13個(gè)噬菌體克隆中包含6個(gè)不同的氨基酸序列，其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCA TACCCGC的噬菌體（P5，P9，P17，P34，P46）被富集，其相應(yīng)的氨基酸序列為RTRLHTR。

圖1 比較選擇的噬菌體克隆在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的不同

2.4 噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn) 預(yù)先用合成多肽RTRLHTR處理后，相應(yīng)噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低。相反，對(duì)照組多肽沒(méi)有顯示這種特異性結(jié)合活性。多肽RTRLHTR在不同濃度（0、0.1、1、10、100及1000 nmol/L）其OD450值分別為0.64±0.04，0.59±0.05，0.54±0.03，0.46±0.05，0.38±0.02及0.29±0.03。多肽RTRLHTR濃度在1000 nmol/L時(shí)能抑制50%的結(jié)合活性。多肽RTRLHTR濃度≥10 nmol/L時(shí)，結(jié)合活性與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而多肽RTRLHTR為低濃度（0、0.1、1 nmol/L）時(shí)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

表113個(gè)克隆的DNA序列

圖2 不同濃度的合成多肽-噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制表現(xiàn)情況

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥在形態(tài)學(xué)上呈良性疾病表現(xiàn)，但在臨床行為學(xué)上具有與惡性腫瘤類(lèi)似的特點(diǎn)。手術(shù)治療是子宮內(nèi)膜異位癥治療中較為有效的手段[4]，然而其有不利的一面，常導(dǎo)致卵巢皮質(zhì)的丟失，卵巢功能的損害，以及較高的復(fù)發(fā)率。藥物治療中GnRH-a是治療子宮內(nèi)膜異位癥的最有效的藥物[5]。然而藥物的作用是暫時(shí)的、保守性的、或是術(shù)前處理用的[6]，還伴隨明顯的不良反應(yīng)，這些都降低了患者的依從性。究其原因主要是這些激素治療不能選擇性地作用于異位內(nèi)膜細(xì)胞。

腫瘤靶向治療是將高度特異性的親腫瘤物質(zhì)作為載體，使其攜帶抗腫瘤藥物特異性對(duì)腫瘤部位進(jìn)行靶向藥物治療，成為腫瘤治療的新途徑[7-8]。小分子多肽是一種理想的抗腫瘤靶向藥物的載體，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易制備，且對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng)，無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[9]。而噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是篩選腫瘤細(xì)胞表面特異性結(jié)合肽的強(qiáng)有力、高通量的一種生物學(xué)技術(shù)，能夠快速篩選出與靶分子親和力高的配體，其最大的優(yōu)勢(shì)即實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合[10]。這為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療提供新的方法。目前以腫瘤細(xì)胞為靶標(biāo)，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)在體外已成功篩選到能與不同腫瘤細(xì)胞如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌等細(xì)胞表面特異性結(jié)合的多肽[11-12]。國(guó)外也有學(xué)者曾報(bào)道過(guò)子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合肽的篩選[13]，國(guó)內(nèi)尚無(wú)研究子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合多肽的篩選的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究中，在采用噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用體外快速差減篩選技術(shù)，篩選特異性結(jié)合到子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的多肽，能有效減少非特異性結(jié)合，提高篩選效率[14]。我們經(jīng)過(guò)5輪的差減篩選，噬菌體濃度從0.9±0.2到26.9±1.9，第5輪中生物淘洗的濃度是第1輪中的30倍，提示結(jié)合的噬菌體被富集了。然后經(jīng)過(guò)5輪差減篩選的50個(gè)藍(lán)斑被隨機(jī)選取，用于ELISA試驗(yàn)及DNA測(cè)序，結(jié)果顯示有13個(gè)噬菌體包含6個(gè)氨基酸序列，其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌體被富集，其相應(yīng)的氨基酸序列為RTRLHTR，這提示了插入序列所編碼的多肽可能具有子宮內(nèi)膜異位癥靶向性的潛能。通過(guò)DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列RTRLHTR最具有潛在研究?jī)r(jià)值，為了驗(yàn)證脫離了噬菌體衣殼蛋白的多肽是否仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞特異親和力，以及多肽與其對(duì)應(yīng)的噬菌體是否競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于同一結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行了噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)?；瘜W(xué)合成多肽RTRLHTR后進(jìn)行噬菌體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明預(yù)先用合成多肽RTRLHTR處理后，相應(yīng)噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低，說(shuō)明脫離了噬菌體的多肽仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞特異親和力，進(jìn)一步表明其為子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞表面的特異性結(jié)合肽。

綜上所述，我們利用噬菌體展示技術(shù)篩選并鑒定了一個(gè)新型多肽序列RTRLHTR，該多肽對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞有高親和力，為藥物靶向傳遞至這些異位內(nèi)膜細(xì)胞提供候選。這個(gè)多肽技術(shù)能被用于連接到包含脂質(zhì)體的激素治療，同樣能改善激素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥治療作用的特異性和有效性，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)激素治療療效的改善都有一定的作用，既能導(dǎo)致異位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而又沒(méi)有全身的不良反應(yīng)?？赡転樽訉m內(nèi)膜異位癥的早期診斷、復(fù)發(fā)及治療提供新的方向，本研究標(biāo)本數(shù)量有限，要進(jìn)一步明確特異性結(jié)合肽與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性并推廣至臨床尚需增大樣本量的研究。另外仍有較多問(wèn)題需要進(jìn)一步的研究，包括親和力的改善，藥代動(dòng)力學(xué)的研究，以及多肽在活體動(dòng)物上干預(yù)的應(yīng)用等。