顏林志,曹丹,王樂丹,李文桔,呂杰強
(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科,浙江 溫州 325027)
子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女常見的一種良性疾病,但是它的一些生物學行為和惡性腫瘤相類似。近年來,腫瘤靶向治療是腫瘤臨床治療的熱點之一,而在子宮內(nèi)膜異位癥的治療中尚沒有特異性的藥物能到達病灶局部并形成有效的殺傷濃度,因此子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療將成為解決這一問題的重要手段。噬菌體展示技術(shù)被認為是篩選腫瘤細胞表面特異性結(jié)合肽的一種生物學技術(shù)[1],目前已被廣泛應用于腫瘤抗原篩選、單克隆抗體制備等[2-3],為研究子宮內(nèi)膜異位癥的靶向治療提供了新的方法。本研究在噬菌體展示基礎(chǔ)上,以子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜為靶標,通過噬菌體展示的隨機7肽庫篩選子宮內(nèi)膜異位癥特異性結(jié)合多肽,鑒定篩選的陽性噬菌體的親和性及特異性,并分析這些多肽的氨基酸序列,為研究多肽在子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷和治療方面提供研究資料。
1.1 材料
1.1.1 試劑:噬菌體隨機7肽庫購自美國New England Biolabs公司,文庫滴度為2×1013pfu/mL,隨機多樣性為1.28×109,大腸桿菌ER2738購自北京Biovector生物技術(shù)有限公司,HRP-抗M13單抗及M13K07購自上海生工生物工程有限公司,鼠抗人細胞角蛋白19抗體購自北京中杉金橋公司,IV型膠原酶、DNasel及DMEM/F-12購自美國Gibco公司,鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷購自北京益強生科技有限公司。
1.1.2 標本:本研究入選2016年1月至6月在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院的子宮內(nèi)膜異位癥IIIIV期(按美國AFS分類)的育齡期女性。共有10位經(jīng)手術(shù)和組織學確診為子宮內(nèi)膜異位癥的患者入選。所有的在位/異位內(nèi)膜標本均在增殖期通過診斷性刮宮/腹腔鏡下囊腫剔除術(shù)獲得,分為2組:異位內(nèi)膜組(n=10)和在位內(nèi)膜組(n=10,來自同組的同個患者),患者在術(shù)前6個月內(nèi)未接受過如GnRH-a或性激素等的激素治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核批準。
1.2 方法
1.2.1 細胞來源:組織在無菌條件下獲取后,用乳酸林格液濕潤,再用PBS液清洗3~5次,立即低溫儲存在液氮中。組織融化后經(jīng)PBS液洗滌2次,剪碎至1 mm3,1 mg/mL的IV型膠原酶于水浴搖床消化1 h,然后加入DNase1(15 U/mL)繼續(xù)消化30 min,消化液分別經(jīng)過100目和400目篩網(wǎng),濾液4 ℃、800×g離心5 min,沉淀細胞即為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。細胞再用含15% FBS的DMEM/F-12重懸,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代。應用玻片法,加鼠抗人細胞角蛋白19抗體進行免疫組織化學染色,鑒定子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的純度。
1.2.2 差減篩選:收集子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞,重懸于1% BSA的DMEM無血清培養(yǎng)液,調(diào)整細胞數(shù)為1×107/mL。取100 μL在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞,加入噬菌體隨機7肽庫10 μL于4 ℃孵育2 h。將細胞和噬菌體的混懸液加在200 μL鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成的有機分離液上,10000×g、4 ℃離心10 min。吸出水相里未結(jié)合的噬菌體肽庫與100 μL異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞于4 ℃孵育3 h離心。取出有機相內(nèi)沉淀物,其為能與異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞結(jié)合的噬菌體,轉(zhuǎn)移沉淀物至新的EP管中,加入200 μL處于對數(shù)生長期的大腸桿菌ER2738,37 ℃孵育30 min,復蘇與異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞結(jié)合的噬菌體。對淘洗后的噬菌體進行測滴度、擴增、純化,進入下一輪差減篩選,計數(shù)每一輪淘洗和擴增后的噬菌體數(shù)目。如此重復5個循環(huán),測定每一輪淘洗和擴增后的滴度。
1.2.3 ELISA:經(jīng)過5輪生物淘洗后,隨機挑選50個藍斑進行陽性噬菌體克隆的鑒別,每個噬菌體克隆一式三份進行ELISA實驗。將細胞(異位/在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞)以104/孔接種入96孔板,過夜培養(yǎng),無血清培養(yǎng)1 h;4%多聚甲醛室溫固定20 min;封閉液封閉2 h;分別加入上述50個陽性噬菌體克?。?010pfu/孔),陰性對照PBS和M13K07,37 ℃孵育2 h;加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中,室溫孵2 h;最后加入200 μL/孔的TMB顯色液,使用微板閱讀器設置在450 nm。
1.2.4 DNA測序和BLAST匹配:經(jīng)過ELISA實驗,OD450值大于0.5的共有13個噬菌體克隆被鑒別,提取這些噬菌體DNA,由上海Sangon Biotech有限公司進行測序分析,通過DNA測序結(jié)果推導出多肽序列。通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫進行BLAST匹配分析。
1.2.5 噬菌體競爭抑制實驗:將異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞以104/孔接種入96孔板,過夜培養(yǎng)后;無血清培養(yǎng)1 h;然后用封閉液37 ℃封閉2 h;PBS系列稀釋(0、0.1、1、10、100、1000 nmol/L)合成的多肽RTRLHTR,并與細胞4 ℃孵育1 h,再與2×1011pfu噬菌體P5于4 ℃繼續(xù)孵育1 h,加入HRP-抗M13單抗以1∶6000稀釋于封閉液中,室溫孵2 h;最后加入200 μL/孔的TMB顯色液,使用微板閱讀器設置在450 nm。以肽庫中無關(guān)噬菌體編碼的非特異性多肽作為陰性對照,實驗重復3次。
1.3 統(tǒng)計學處理方法 數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行分析,計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗,多組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 差減篩選 本研究經(jīng)過5輪差減篩選,產(chǎn)出噬菌體的數(shù)量(106pfu/mL)在研究1、2、3、4、5中分別為0.9±0.2,3.3±0.6,8.2±1.2,14.2±1.2及26.9±1.9,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究5中生物淘洗的濃度是研究1中的30倍。
2.2 ELISA 在實驗中OD450值大于0.5的共有13個噬菌體克隆被選擇,這13個子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆其OD450值分別為0.61±0.05,0.63±0.04,0.56±0.05,0.72±0.06,0.58±0.08,0.65±0.03,0.71±0.03,0.58±0.05,0.59±0.02,0.52±0.04,0.66±0.06,0.77±0.05及0.62±0.04,而對照組的OD450值為0.07~0.14,與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的克隆組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。
2.3 DNA測序 經(jīng)過ELISA實驗,其中OD450值大于0.5的共有13個子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的噬菌體克隆被選出(P2,P5,P9,P11,P14,P17,P22,P24,P31,P34,P37,P45,P46),見表1。提取這些噬菌體DNA,由上海Sangon Biotech有限公司進行測序分析,結(jié)果顯示13個噬菌體克隆中包含6個不同的氨基酸序列,其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCA TACCCGC的噬菌體(P5,P9,P17,P34,P46)被富集,其相應的氨基酸序列為RTRLHTR。
圖1 比較選擇的噬菌體克隆在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的不同
2.4 噬菌體競爭抑制實驗 預先用合成多肽RTRLHTR處理后,相應噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低。相反,對照組多肽沒有顯示這種特異性結(jié)合活性。多肽RTRLHTR在不同濃度(0、0.1、1、10、100及1000 nmol/L)其OD450值分別為0.64±0.04,0.59±0.05,0.54±0.03,0.46±0.05,0.38±0.02及0.29±0.03。多肽RTRLHTR濃度在1000 nmol/L時能抑制50%的結(jié)合活性。多肽RTRLHTR濃度≥10 nmol/L時,結(jié)合活性與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而多肽RTRLHTR為低濃度(0、0.1、1 nmol/L)時,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。
表113個克隆的DNA序列
圖2 不同濃度的合成多肽-噬菌體競爭抑制表現(xiàn)情況
子宮內(nèi)膜異位癥在形態(tài)學上呈良性疾病表現(xiàn),但在臨床行為學上具有與惡性腫瘤類似的特點。手術(shù)治療是子宮內(nèi)膜異位癥治療中較為有效的手段[4],然而其有不利的一面,常導致卵巢皮質(zhì)的丟失,卵巢功能的損害,以及較高的復發(fā)率。藥物治療中GnRH-a是治療子宮內(nèi)膜異位癥的最有效的藥物[5]。然而藥物的作用是暫時的、保守性的、或是術(shù)前處理用的[6],還伴隨明顯的不良反應,這些都降低了患者的依從性。究其原因主要是這些激素治療不能選擇性地作用于異位內(nèi)膜細胞。
腫瘤靶向治療是將高度特異性的親腫瘤物質(zhì)作為載體,使其攜帶抗腫瘤藥物特異性對腫瘤部位進行靶向藥物治療,成為腫瘤治療的新途徑[7-8]。小分子多肽是一種理想的抗腫瘤靶向藥物的載體,其結(jié)構(gòu)簡單,容易制備,且對腫瘤組織穿透力強,無免疫原性等優(yōu)點[9]。而噬菌體展示技術(shù)被認為是篩選腫瘤細胞表面特異性結(jié)合肽的強有力、高通量的一種生物學技術(shù),能夠快速篩選出與靶分子親和力高的配體,其最大的優(yōu)勢即實現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合[10]。這為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展、診斷及治療提供新的方法。目前以腫瘤細胞為靶標,應用噬菌體展示技術(shù)在體外已成功篩選到能與不同腫瘤細胞如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌等細胞表面特異性結(jié)合的多肽[11-12]。國外也有學者曾報道過子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合肽的篩選[13],國內(nèi)尚無研究子宮內(nèi)膜異位癥的特異性結(jié)合多肽的篩選的文獻報道。
本研究中,在采用噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應用體外快速差減篩選技術(shù),篩選特異性結(jié)合到子宮內(nèi)膜異位癥細胞的多肽,能有效減少非特異性結(jié)合,提高篩選效率[14]。我們經(jīng)過5輪的差減篩選,噬菌體濃度從0.9±0.2到26.9±1.9,第5輪中生物淘洗的濃度是第1輪中的30倍,提示結(jié)合的噬菌體被富集了。然后經(jīng)過5輪差減篩選的50個藍斑被隨機選取,用于ELISA試驗及DNA測序,結(jié)果顯示有13個噬菌體包含6個氨基酸序列,其中DNA序列為CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌體被富集,其相應的氨基酸序列為RTRLHTR,這提示了插入序列所編碼的多肽可能具有子宮內(nèi)膜異位癥靶向性的潛能。通過DNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列RTRLHTR最具有潛在研究價值,為了驗證脫離了噬菌體衣殼蛋白的多肽是否仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細胞特異親和力,以及多肽與其對應的噬菌體是否競爭結(jié)合于同一結(jié)合位點,進行了噬菌體競爭抑制實驗?;瘜W合成多肽RTRLHTR后進行噬菌體競爭抑制實驗,結(jié)果表明預先用合成多肽RTRLHTR處理后,相應噬菌體克隆P5與子宮內(nèi)膜異位癥細胞的結(jié)合能力呈多肽劑量依賴性降低,說明脫離了噬菌體的多肽仍具有子宮內(nèi)膜異位癥細胞特異親和力,進一步表明其為子宮內(nèi)膜異位癥細胞表面的特異性結(jié)合肽。
綜上所述,我們利用噬菌體展示技術(shù)篩選并鑒定了一個新型多肽序列RTRLHTR,該多肽對子宮內(nèi)膜異位癥細胞有高親和力,為藥物靶向傳遞至這些異位內(nèi)膜細胞提供候選。這個多肽技術(shù)能被用于連接到包含脂質(zhì)體的激素治療,同樣能改善激素對子宮內(nèi)膜異位癥治療作用的特異性和有效性,對子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)激素治療療效的改善都有一定的作用,既能導致異位內(nèi)膜細胞生長的抑制而又沒有全身的不良反應??赡転樽訉m內(nèi)膜異位癥的早期診斷、復發(fā)及治療提供新的方向,本研究標本數(shù)量有限,要進一步明確特異性結(jié)合肽與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性并推廣至臨床尚需增大樣本量的研究。另外仍有較多問題需要進一步的研究,包括親和力的改善,藥代動力學的研究,以及多肽在活體動物上干預的應用等。