王四海，施蕊，陳劍，楊宇明，王娟

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院 云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南森林植物保護(hù)與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650201；2.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明650224)

蒜頭果(MalaniaoleiferaChun et S.Lee)為鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬(Malania)唯一的孑遺植物，是中國滇東南與桂西喀斯特山地特有的珍稀物種，現(xiàn)僅零星分布于云南東南部的廣南、富寧縣和廣西西部的石灰?guī)r山區(qū)。1980年蒜頭果才被正式命名[1]，1981年發(fā)現(xiàn)種仁油中富含神經(jīng)酸，其巨大的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值得到初步認(rèn)識[2]。蒜頭果種仁富含高達(dá)51.9%-64.5%的油脂，種仁油中神經(jīng)酸含量高達(dá)40%-67%[2-6]。蒜頭果是目前發(fā)現(xiàn)含神經(jīng)酸最高的植物，是最為理想的開發(fā)神經(jīng)酸產(chǎn)品的資源植物[6]，有著巨大的經(jīng)濟(jì)開發(fā)潛力[7]。

蒜頭果分布狹域，被廣泛認(rèn)識的時(shí)間較短，盡管當(dāng)?shù)赜惺秤盟忸^果種仁油的記載，但使用范圍較狹窄，使用量不大[8]。蒜頭果種仁富含蒜頭果蛋白[9]，這種蛋白是一種高毒性植物蛋白[10]，在當(dāng)?shù)匾灿姓`食蒜頭果種子中毒的事件。蒜頭果油和蒜頭果蛋白都是從種仁中提取，因此蒜頭果油在作為食品和保健品原料的安全性受到關(guān)注。為了測試蒜頭果油的食用安全性，用昆明種小鼠進(jìn)行了蒜頭果油急性毒性試驗(yàn)，為蒜頭果油的利用安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物和動(dòng)物

蒜頭果油由種仁機(jī)械壓榨提取。昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，選擇狀況良好的80只健康小鼠，體重為22.3-25.8g，雌雄各半，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)法分為4組，即：陰性對照組(簡稱：陰性組)、食用油對照組(簡稱：食用油組)、低劑量組和高劑量組，每組各20只，雌雄各半，使各組昆明小鼠體重差異不超過單性別小鼠平均體重的20%。昆明小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物與劑量

根據(jù)《新資源食品管理辦法》和《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，結(jié)合本供試品特性，陰性組、食用油組和高劑量組均按40mL/(kg·bw)的給藥容積于24h內(nèi)分別給予對應(yīng)的藥液3次，低劑量組則給予2次，使低、高劑量組終劑量分別達(dá)81.6g/(kg·bw)和122.4g/(kg·bw)(表1)。第1、2次給藥間隔為3h50min至4h，第2、3次給藥間隔為3h57min至4h3min。陰性組對照品為飲用水，食用油組對照品為金龍魚食用調(diào)和油。

表1 各組劑量設(shè)置情況

注：劑量根據(jù)25℃時(shí)蒜頭果油密度1.02g/mL計(jì)算。

1.3 指標(biāo)觀察方法

給藥當(dāng)天每次灌胃給藥前、后均需觀察小鼠一般癥狀和體征，其中給藥后需立即連續(xù)觀察小鼠反應(yīng)約2.5h；給藥之后每天觀察小鼠一般癥狀和體征1-2次，連續(xù)觀察14d。觀察內(nèi)容主要包括小鼠飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物、死亡情況及中毒反應(yīng)癥狀及其起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、是否可逆及恢復(fù)時(shí)間等。

于給藥當(dāng)天給藥前及給藥后第1d、3d、5d、7d、10d、14d稱重，并計(jì)算各組小鼠的體重增長幅度。對中途死亡的小鼠及觀察期結(jié)束后的存活小鼠進(jìn)行肢體解剖，觀察小鼠各組織和器官的體積、顏色、質(zhì)地等有無異常。把所有試驗(yàn)死亡的小鼠分別與劑量和死亡時(shí)間進(jìn)行相關(guān)分析。

1.4 試驗(yàn)地點(diǎn)與數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)委托云南省藥物研究所藥物安全性評價(jià)中心完成。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17 .0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般癥狀和體征表現(xiàn)

陰性組給藥當(dāng)天和給藥后連續(xù)觀察14d，該組小鼠均未見明顯異常。食用油組在第一次給藥當(dāng)天和第1d有20只相繼出現(xiàn)軟便、稀便或油樣便，其中有5只(♀1和♂4)活動(dòng)減少，2只(♀2)出現(xiàn)驚跳反射，1只(♂1)腹部腫脹；給藥后第2d至第14d該組所有小鼠基本恢復(fù)正常，未見明顯異常情況。低劑量組在第一次給藥當(dāng)天和第1d相繼有18只(♀10和♂8)出現(xiàn)軟便、稀便或油樣便，有1只(♂1)在第4d至第8d仍出現(xiàn)油樣便、腹部腫脹，第9d恢復(fù)正常，有2只(♀1和♂1)小鼠分別在給藥后的第6d和第8d死亡，其余17只小鼠在給藥后的第2d至第14d未見明顯異常。高劑量組在給藥后的當(dāng)天、第1d和第2d相繼20只出現(xiàn)軟便、稀便或油樣便，10只(♀6和♂4)活動(dòng)減少，4只(♀2和♂2)出現(xiàn)驚跳反射；高劑量組給藥后的第1d 1只(♂1)死亡，第2d 3只(♀1和♂2)死亡，第3d 1只(♂1)死亡，其余小鼠在給藥后的第3d至第14d基本恢復(fù)正常，未見明顯異常情況(表2)。所有死亡的小鼠肢體解剖都基本表現(xiàn)為形體消瘦，胃、腸粘膜充血，胃、腸脹氣，直腸腸腔不同程度擴(kuò)張，內(nèi)有淡黃色質(zhì)地堅(jiān)硬的固體物質(zhì)。

小鼠的死亡數(shù)量有明顯的劑量-反應(yīng)和時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，其中死亡數(shù)量與劑量呈正相關(guān)，死亡時(shí)間與劑量呈負(fù)相關(guān)，即隨著劑量的升高，小鼠的死亡數(shù)增加，且死亡時(shí)間提前(圖1)。

表2 出現(xiàn)異常反應(yīng)小鼠數(shù)量(♀/♂)

注：表中僅為主要的異常反應(yīng)，且包括整個(gè)觀察過程中發(fā)生上述癥狀的小鼠。

圖1 小鼠死亡數(shù)量分別與劑量和天數(shù)的相關(guān)關(guān)系

2.2 體重變化

雌性小鼠個(gè)體體重，與陰性組相比較，食用油組在給藥后的第1d，體重顯著減輕，低劑量組和高劑量組在給藥后的第1d和第3d體重顯著減輕；與食用油組相比較，低劑量組和高劑量組在給藥后的第1d和第3d體重顯著減輕(表3)。

表3 雌性小鼠體重變化

注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**與陰性組比較有顯著性差異(P<0.01)，#/##與食用油組比較有顯著性差異(P<0.05/0.01)。

雄性小鼠個(gè)體體重，與陰性組相比較，食用油組在給藥后的第1d、第3d、第5d，體重與陰性組有極顯著差異，在第7d、第10d有顯著差異；低劑量組在給藥后的第1d、第3d、第5d，體重與陰性組有極顯著差異，在第7d、第10d、第14d有顯著差異；高劑量組在給藥后的所有天數(shù)都與陰性組的重量有極顯著性差異。與食用油組相比較，低劑量組體重與其并沒有表現(xiàn)出明顯的差異性，但與高劑量組在第5d、第7d表現(xiàn)出極顯著差異，在第10d、第14d表現(xiàn)出顯著差異。雄性小鼠個(gè)體體重在高劑量組和低劑量組之間也表現(xiàn)出顯著差異(表4)。

表4 雄性小鼠體重變化

注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*/**與陰性組比較有顯著性差異(P<0.05/0.01)，#/##與食用油組比較有顯著性差異(P<0.05/0.01)，Δ/ΔΔ與高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05/0.01)。

由表5可知，食用油組、低劑量組、高劑量組分別與陰性組比較，雌性小鼠體重增長在給藥后第1d均有顯著差異(P<0.01)，均表現(xiàn)出體重增加緩慢，并且高劑量組為負(fù)增長；在給藥后的第3d至第14d體重增長雖有差異但并不顯著。低劑量組、高劑量組分別與食用油組比較，雌性小鼠體重增長在給藥后第1d有顯著差異(P<0.01)，在給藥后的第3d至第14d差異不顯著。雌性小鼠體重增加在低劑量組和高劑量組之間始終沒有顯著性差異(P>0.05)。

由表6可知，雄性小鼠的體重增長在給藥后的第1d與陰性組相比較都表現(xiàn)出顯著差異(P<0.01)，體重增長較慢，高劑量組表現(xiàn)出負(fù)增長；但是，在第10d低劑量組和高劑量組雄性小鼠體重增加幅度都高于陰性組，且差異顯著(P<0.01)。與食用油組比較，只有高劑量組在第1d表現(xiàn)出體重明顯減慢(負(fù)增長，P<0.01)，在第10d體重增加，又明顯大于食用油組(P<0.05)。雌性小鼠低劑量組的體重增加在第1d顯著高于高劑量組(P<0.05)，但在第10d又顯著低于高劑量組(P<0.05)。

給藥小鼠的體重增長幅度無論是雌性還是雄性在給藥后的第1d都明顯減慢，且高劑量組表現(xiàn)出負(fù)增長。在第3d至第14d體重增加變快，甚至有些時(shí)段體重增加幅度超過陰性組和食用油組，但在整個(gè)受試過程中給藥小鼠體重總體上都低于陰性組和食用油組。

表5 雌性小鼠體重增長幅度

注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**與陰性組比較有顯著性差異(P<0.01)，##與食用油組比較有顯著性差異(P<0.01)。

表6 雄性小鼠體重增長幅度

注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**與陰性組比較有顯著性差異(P<0.01)，#/##與食用油組比較有顯著性差異(P<0.05/P<0.01)，Δ與高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)期間，小鼠在一般癥狀、體征方面的異常主要包括軟便、稀便和油樣便、腹部鼓脹、活動(dòng)減少、驚跳反射等，上述癥狀的出現(xiàn)可能主要與胃腸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂相關(guān)；在糞便性狀異常方面，食用油組小鼠出現(xiàn)油樣便的時(shí)間較早(第1次給藥后大部分小鼠開始出現(xiàn))，而蒜頭果油各劑量組在第2次、第3次給藥后才開始陸續(xù)出現(xiàn)，且大部分小鼠以軟便或稀便為主，至給藥后第2d和第3d，食用油組所有小鼠和高劑量組存活小鼠逐漸恢復(fù)正常，而低劑量組3只小鼠逐漸開始出現(xiàn)毒性反應(yīng)癥狀，除個(gè)別小鼠緩慢恢復(fù)外，剩余2只小鼠死亡，其死亡原因與高劑量組中途死亡小鼠一樣，可能也與胃腸道功能失調(diào)甚至障礙有關(guān)；同為油類物質(zhì)，食用油也可使小鼠出現(xiàn)胃腸道系統(tǒng)功能失調(diào)相關(guān)癥狀，但其對胃腸功能的損傷為短暫性，停止藥物后小鼠能在短時(shí)間內(nèi)(約48h)恢復(fù)正常，而蒜頭果油可對個(gè)別或少數(shù)小鼠神經(jīng)性系統(tǒng)特別是胃腸系統(tǒng)功能產(chǎn)生程度較為嚴(yán)重的，甚至危及生命的消耗性損傷，最終使小鼠死亡。

根據(jù)小鼠腸腔不同程度的擴(kuò)張，內(nèi)有顏色和質(zhì)地類似動(dòng)物飼料的堅(jiān)硬固體物質(zhì)及小鼠出現(xiàn)的一系列胃腸系統(tǒng)癥狀，推測供試品可能引起小鼠腸壁肌肉運(yùn)動(dòng)功能紊亂、障礙，不能有力地推動(dòng)腸道內(nèi)容物通暢運(yùn)行并排出體外，而使腸道內(nèi)容物迅速或逐漸堆積，最終形成質(zhì)地堅(jiān)硬的固體物質(zhì)堵塞腸道，即供試品可能在使小鼠出現(xiàn)胃腸功能紊亂、障礙后，繼發(fā)出現(xiàn)類似臨床運(yùn)動(dòng)障礙性腸梗阻的情況，從而導(dǎo)致小鼠死亡。蒜頭果油24h內(nèi)多次給藥可使大多數(shù)小鼠出現(xiàn)胃腸系統(tǒng)功能失調(diào)相關(guān)癥狀，甚至使少數(shù)小鼠死亡，但多數(shù)小鼠可于停止給藥72h后逐漸恢復(fù)正常。

給予食用油和蒜頭果油對小鼠的體重均有明顯影響，可使小鼠體重下降或增長緩慢，其中以雄性小鼠更為明顯；但食用油對小鼠體重的影響明顯小于蒜頭果油，從給藥后第5d開始，食用油組與陰性組雄性小鼠平均體重差距逐漸縮小并趨于相當(dāng)，而至給藥后第14d高劑量組雄性小鼠平均體重仍明顯小于陰性組；給藥后食用油組平均體重增長幅度雖有所波動(dòng)，甚至在部分時(shí)間點(diǎn)小于給藥組，但該組小鼠體重從未出現(xiàn)過負(fù)增長，而高劑量組給藥后第1d雌、雄小鼠平均體重增長幅度均為負(fù)值，表明該組大多數(shù)小鼠體重給藥后均出現(xiàn)下降。蒜頭果油24h內(nèi)多次給藥可使大多數(shù)小鼠體重在短時(shí)間內(nèi)下降或出現(xiàn)增長緩慢，其中以雄性小鼠較為明顯。

在本實(shí)驗(yàn)條件下蒜頭果油24h內(nèi)多次灌胃給予小鼠，其最小致死量(MLD)為81.6g/(kg·bw)，相當(dāng)于神經(jīng)酸含量為32.6-49.0g/(kg·bw)，分別折合成人每日最大用量和小鼠等效劑量的約983和80倍；使用“查表法”[11]大致估算其LD50為126.8g/(kg·bw)，相當(dāng)于神經(jīng)酸含量為50.7-76.1g/(kg·bw)，分別折合成人每日最大用量和小鼠等效劑量的約1 528倍和124倍。蒜頭果油具有較寬的安全劑量范圍，但若在短時(shí)間內(nèi)大量服用可能會致胃腸系統(tǒng)功能紊亂甚至發(fā)生障礙。