趙 凡，曾秀麗，張姍姍

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850000)

被譽為“花中之王”的牡丹在長期的培育中已經(jīng)成為世界上園藝化程度最高的花卉之一，在我國已有1500多年的園藝栽培歷史。作為觀賞植物，在牡丹的眾多性狀中，花型一直是一個重要的因素,它是由花瓣、雄蕊、雌蕊、萼片的形態(tài)數(shù)量變異及其排列組合決定的。從其應用角度而言，牡丹花型是其重要的觀賞特征之一，直接影響到牡丹的觀賞價值；從分類角度而言,花型分類是一種重要的分類方法，能夠客觀地反映牡丹品種的演進規(guī)律。重瓣程度的高低無疑對它的觀賞效果有著極大的影響，故而有必要研究其重瓣性瓣化機理，進一步改變其花型從而提高觀賞性，2016年，西藏自治區(qū)農(nóng)科院蔬菜所牡丹課題組首次在拉薩馴化栽培的大花黃牡丹中發(fā)現(xiàn)了2株雄蕊瓣化后單花花瓣數(shù)量達到28瓣，雌蕊為3～4個的變異材料，而多年的野外調查發(fā)現(xiàn)大花黃牡丹的花瓣數(shù)量為11～12，從未發(fā)現(xiàn)過重瓣變異植株。

轉錄組是特定組織細胞在某一發(fā)育階段轉錄出來的所有RNA的集合。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程的中的分子機理。轉錄組測序(RNA-Seq)是利用第2高通量測序技術進行cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本。隨著后基因組的時代的到來，轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等各種組學相繼出現(xiàn)，其中轉錄組學是率先發(fā)展起來以及應用最廣泛的技術[1]。遺傳學中心法則表明，遺傳信息在精密的調控下通過信使5RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質。因此，mRNA被認為是DNA與蛋白質生物之間信息傳遞的媒介，而所有表達基因的身份以及其轉錄水平，一起被稱作轉錄組[2](Transcriptome)轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA的總和，主要包括非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)[3]。轉錄組研究是基因功能及結構研究的基礎和出發(fā)點，了解轉錄組是解讀基因組功能元件和揭示細胞及組織中分子組成所必需的，并且對理解機體發(fā)育和疾病具有重要的作用。事實上，大花黃牡丹雄蕊瓣化也是機體病變的過程，應用轉錄組學技術研究大花黃牡丹雄蕊瓣化將會是一個直接有效的方法。

因此本實驗將從生態(tài)學和轉錄組2個方面找出導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的因子。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本實驗在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所園區(qū)大棚內開展。該實驗基地的海拔為3650 m,光照充足，紫外線強。雨季多集中在6-9月，土壤為沙壤土，保水保肥能力一般。

1.2 材料

從林芝已移栽到拉薩的六年生大花黃牡丹瓣化植株2棵，大花黃牡丹正常植株3棵、液氮罐、干冰、RNA保存液、鋁紙、游標卡尺、記號筆、標簽、記錄本。

1.3 方法

本實驗采集正常株和變異株對照試驗，在形態(tài)學上進行花部結構上的觀察，選取花芽分化時期頂芽，制作石蠟切片，顯微鏡觀察頂芽結構特征。在轉錄組方面進行RNA測序unigene的差異性分析。提取大花黃牡丹雄蕊瓣化群體和正常群體樣本總RNA，加接頭，建庫。然后利用11umina HIseq2000測序平臺進行生物學分析及功能注釋。兩種材料轉錄組進行比較分析，鑒定雄蕊瓣化形成時期相關差異表達基因。

2 結果與分析

2.1 大黃牡丹正常株和變異株形態(tài)觀察

從表1可知，通過3個時間的觀察，記錄大花黃牡丹正常株和變異株一些形態(tài)指標的觀察，發(fā)現(xiàn)變異植株，從冠幅、長枝長、長枝莖粗、短枝長、短枝莖粗、花蕾數(shù)等方面的優(yōu)勢要強于正常株，分別高于正常株0.32 m、0.40 m、0.41 cm、0.13 m、0.04 cm、3.5個，然而在長短枝平均生長量上要弱于正常株0.04 m，正常株與變異株在長枝長度上存在極顯著性差異，在長枝莖粗上有顯著性差異，在短枝長度和莖粗上沒有顯著性差異。

2.2 花芽分化不同時期[4]的觀察

2017年11月23日開始，間隔10 d從正常和變異的大花黃牡丹植株上采集花芽，并在體式顯微鏡下進行觀察，采集4次，于2017年12月23日結束。通過4次采集花芽的觀察得出，正?；ㄑ縿傞_始被四周的葉芽包圍，且高度高于其中的花芽，到后面花芽生長的很快，葉芽和花芽的數(shù)量也不斷增加。但葉芽的生長速度要弱于花芽，到后面花芽也高于葉芽；相比較而言，變異花芽從剛開始觀察，其花芽就高于葉芽，到后面花芽和葉芽的高度差越來遠大，同等時期花芽和葉芽都比正常株長得弱小，1個混合芽中，花芽和葉芽生長速度的快慢、數(shù)量、高度差、或許是導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的1個形態(tài)判斷指標。

2.3 轉錄測序分析

2.3.1 樣品采集 本實驗于2017年4月18日、2017年5月10日，2017年6月24日，3個時間點，總計118個樣，1個樣1個花蕾，變異樣品9個，正常樣品9個。寫上標簽，用錫箔紙包裹，置于-80 ℃液氮中保存，于2017年8月底，送至武漢進行樣品轉錄組分析。

注：2017-3-23觀察冠幅、標記的各五個長短枝長度、莖粗平均值，2107-04-13統(tǒng)計標記長短枝得總花蕾數(shù)、2017-05-17統(tǒng)計標記的長短枝生長量均枝。

表2 不同時間采樣情況

2.3.2 樣本檢測、文庫構建和上機測序 對總RNA樣本進行1 %的瓊脂糖電泳檢測RNA樣品是否有降解以及雜質；凱奧k5500分光光度計檢測樣品純度；安捷倫2100RNA Nano 6000 Assay Kit (Agilent Technologies,CA,USA) 檢測RNA樣品的完整性和濃度。總RNA樣本檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁性富集mRNA,向得到的mRNA中加入片段緩沖液使其片段成為短片段，在以片段后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPS、RNaseH和DNA polymerase I繼續(xù)合成cDNA第2鏈，經(jīng)過QIAQUick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進行末端修復、加堿基A、加測序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作。

2.3.3 樣本信息 項目共有18個樣本用于分析，樣本信息名稱對應到檢測時的名稱如表3所示：

2.4 差異基因

2.4.1 差異基因的獲取 從表中通過計算，可以得出TEST01和CONTRIL01差異基因總數(shù)272個、上調基因200個、下調基因72個；TEST02和CONTRIL02差異基因總數(shù)2526個、上調基因1403個、下調基因1123個；TEST03和CONTRIL03差異基因總數(shù)2539個、上調基因736個下調基因1803個。

表3 18個樣本信息名稱對應的檢測名稱

圖1 本本差異基因

2.4.2 差異表達基因韋恩圖 通過比較處理組和參考組，對不同組別之間的差異表達基因作韋恩圖，如下：3個組合加起來共有不重復基因4709個，3個組合互不重合基因4694個，3個組合共同重合的基因有15個。這15個差異基因的部分基因可能是導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的基因。

圖2 差異基因韋恩圖

2.4.3 GO分析 TEST01-CONTRIL01、TEST02-CONTRIL02、TEST03-CONTRIL03 3個組合差異基因將從生物過程(biological process)、細胞組成(cellular component)和分子功能(Molecular Function)3個部分?；蚧虻鞍踪|通過ID對應或者序列注釋的方法找到與之對應的GO編號，而GO編號可用于對應到Term,即功能類別或者細胞定位。

圖3 GO分析樣本1

利用Blast2GO,計算每個Term的基因數(shù)目。并根據(jù)結果繪制柱形圖，結果如下:

TEST01-CONTRIL01組合差異基因被定位到了生物過程(biological process)中代謝過程(Metabolic processs)參與基因52個；細胞過程(Cellular processs)參與基因48個；單一生物體過程(Single-organism processs)參與基因32個；刺激反應(Response to stimulus)參與基因17個；生物調節(jié)(Biological regulation)參與基因15個；發(fā)展過程(Developmental process)參與基因7個；復制過程(Reproductive process)參與基因6個，多微生物過程(Multi-organism process)參與基因6個；細胞組成的組織或生物起源(Cellular component organization or biogenesiss)參與基因6個；多細胞有機體過程(Multicellular organismal process)參與基因2個；生長(Growth)參與基因2個；定位(Localization)參與基因2個；免疫系統(tǒng)過程(Immune system process)參與基因1個。細胞組成(cellular component)中細胞組分(Cell part)參與基因59個；細胞膜組分(Membrane part)參與基因26；細胞器官(Organelle)參與基因29；細胞膜(Membrane)參與基因16個；細胞外區(qū)域(Extracellular region)參與基因9個；細胞器官組分(Organelle part)參與基因9個；復雜的大分子(Macromolecular complex)參與基因8個；細胞外區(qū)組分(Extracellular region part)參與基因2個。分子功能(Molecular Function)中催化作用(Catalytic)參與基因51；粘合物(Binding)參與基因47個；核轉錄因子和綁定(Nucleic acid binding transcription factor)參與基因11個；選擇載體(Electron carrier)參與基因5個;運輸(Transporter)參與基因5個；信號轉換器(Signal transducer)參與基因2個;分子傳感器(Molecular transducer)參與基因1個;分子結構(Structural molecule)參與基因1個；翻譯機構(Translation regulator)參與基因1個；轉錄因子活性，蛋白質綁定(Transcription factor activity,protein binding)參與基因1個。

圖4 GO分析樣本2

TEST02-CONTRIL02組合差異基因被定位到了生物過程(biological process)中細胞過程(Cellular processs)參與基因793個；代謝過程(Metabolic processs)參與基因642個；單一生物體過程(Single-organism processs)參與基因475個；生物調節(jié)(Biological regulation)參與基因317個；細胞組成的組織或生物起源(Cellular component organization or biogenesiss)參與基因199個；刺激反應(Response to stimulus)參與基因314個；發(fā)展過程(Developmental process)參與基因226個；定位(Localization)上下調基因144個；復制過程(Reproductive process)參與基因122個；多細胞有機體過程(Multicellular organismal process)參與基因95個；多微生物過程(Multi-organism process)上下調基因67個；生長(Growth)參與基因20個；生物階段(Biological phase)參與基因9個；免疫系統(tǒng)過程(Immune system process)參與基因15個；生長運轉(Locomotion)參與基因10個；解毒作用(Detoxification)參與基因2個；生物附著(Biological adhesion)參與基因2個；信號(Signaling)參與基因1個；反應(Behavior)參與基因1個；細胞殺傷功能(Cell killing)參與基因1個。細胞組成(cellular component)中細胞組分(Cell part)參與基因943個；細胞器官(Organelle)參與基因577個；細胞器官組分(Organelle part)參與基因322個；復雜的大分子(Macromolecular complex)參與基因187；細胞膜組分(Membrane part)參與基因321個；細胞膜(Membrane)參與基因167個；細胞外區(qū)域(Extracellular region)參與基因95個；復雜的超分子(Supramolecular complex)參與基因27個；細胞接合(Cell junction)參與基因40個；細胞外區(qū)域(Extracellular region part)參與基因9個；關閉的膜腔(Membrane-enclosed lumen)參與基因7個；擬核(Nucleoid)參與基因2個；；病毒粒子部分(Virion part)參與基因2個；其他有機體的一部分(Other organism part)參與基因2個。分子功能(Molecular Function)中粘合物(Binding)參與基因786個；催化作用(Catalytic)參與基因636個；運輸(Transporter)參與基因95個；核轉錄因子和綁定(Nucleic acid binding transcription factor)參與基因97個；分子結構(Structural molecule)參與基因34個；分子功能監(jiān)管機構(Molecular function regulator)參與基因20個；選擇載體(Electron carrier)參與基因35個；信號轉換器(Signal transducer)參與基因21個；分子傳感器(Molecular transducer)參與基因9個；轉錄因子活性，蛋白質綁定(Transcription factor activity,protein binding)參與基因4個；抗氧化(Antioxidant)參與基因4個；抗氧化(Nutrient reservoir)參與基因3個。

圖5 GO分析樣本3

TEST03-CONTRIL03組合差異基因被定位到了生物過程(biological process)中代謝過程(Metabolic processs)參與基因651個；細胞過程(Cellular processs)參與基因652個；單一生物體過程(Single-organism processs)參與基因424個；生物調節(jié)(Biological regulation)參與基因277個；(Response to stimulus)參與基因311個；刺激反應發(fā)展過程(Developmental process)參與基因128個；定位(Localization)參與基因125個；復制過程(Reproductive process)參與基因78個；多細胞有機體過程(Multicellular organismal process)參與基因67個；細胞組成的組織或生物起源(Cellular component organization or biogenesiss)參與基因83個；多微生物過程(Multi-organism process)參與基因68個；免疫系統(tǒng)過程(Immune system process)參與基因29個；生長(Growth)參與基因25個；信號(Signaling)參與基因5個；有節(jié)奏的過程(Rhythmic process)參與基因3個；反應(Behavior)參與基因3個； 復制(Reproduction)參與基因1個；生物附著(Biological adhesion)參與基因2個；生長運轉(Locomotion)參與基因2個。細胞組成(cellular component)中細胞組分(Cell part)參與基因820個；細胞器官(Organelle)參與基因435個；細胞膜組分(Membrane part)參與基因379個；細胞膜(Membrane)參與基因310個；細胞器官組分(Organelle part)參與基因226個；細胞外區(qū)域(Extracellular region)參與基因115個；復雜大分子(Macromolecular complex)參與基因93個；細胞接合(Cell junction)參與基因48個；細胞外區(qū)域(Extracellular region part)參與基因14個；復雜的超分子(Supramolecular complex)參與基因10個；突觸部分(Synapse part)參與基因1個；關閉的膜腔(Membrane-enclosed lumen)參與基因3個。分子功能(Molecular Function)中催化作用(Catalytic)參與基因711個；粘合物(Binding)參與基因703個；核轉錄因子和綁定(Nucleic acid binding transcription factor)參與基因115個；運輸(Transporter)參與基因93個；選擇載體(Electron carrier)參與基因67個；信號轉換器(Signal transducer)參與基因39個；分子結構(Structural molecule)參與基因25個；分子傳感器(Molecular transducer)參與基因22個；分子功能監(jiān)管機構(Molecular function regulator)參與基因27個；氧化(Antioxidant)參與基因6個；抗氧化(Nutrient reservoir)參與基因5個；轉錄因子活性，蛋白質綁定(Transcription factor activity,protein binding)參與基因2個。

2.4.4 KEGG通路分析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes,京都基因與基因組百科全書)是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫，在給出染色體中一套完整基因的情況下，它可以對蛋白質交互(互動)網(wǎng)絡在各種各樣的細胞活動中起的作用進行預測。為了方便查看PAthway在每個比較中的富集程度，取所有樣品的顯著性Map的并集，并根據(jù)q值做出分布圖，結果如下：

圖6 KEGG通路分析

取所有樣品富集的GO條目進行分析，縱坐標為GO的條目，橫坐標為不同樣品的名稱，不同的顏色，代表不同的富集程度。通過圖表可以看出，3個對照組合樣品PAthway的富集程度顯著性，主要體現(xiàn)在DNA replication(DNA復制)、Homologous reciombination(同源性重組)、Mismatch repair(錯配修復)、Nucleotide excision repair(核苷酸切除修復)、Plant hormone signal transduction(植物荷爾蒙信號傳導)、Non-homologous end-joining(非同源末端連接物)、Base excision repair(堿基切除修復)、Phenylpopanoid biosythesis(苯丙素生物合成)、Isoflavonoid biosynthesis(異黃酮類生物合成)、Brassinosteroid biosynthesis(油菜類固醇生物合成)、Thiamine metabolism(硫胺素新陳代謝)這11個代謝過程。

3 結 論

通過GO和KEGG通路分析，將差異基因比對到不同的分子功能及代謝途徑中，發(fā)現(xiàn)兩個基因調控的蛋白質和大花黃牡丹的雄蕊瓣化有關。參考Hua Ling等[5]關于油菜雄性不育和Seonghoe Jang等[6]關于水稻多花的研究。分別篩選得到GDSL esterase/lipase At1g54790、Polygalacturonase-inhibiting protein 2個基因參與大花黃牡丹的雄蕊瓣化。

4 討 論

針對Hua Ling等人關于油菜雄性不育和Seonghoe Jang等人關于水稻多花的文章。油菜雄性不育代謝過程中的GDSL esterase/lipase At1g54790基因和大花黃牡丹雄蕊瓣化所調控的基因有相似之處。但是雄蕊的瓣化最終的結果就是不育。不育并一定就代表雄蕊瓣化，這其中有許多基因的協(xié)同作用，因而只能說油菜的不育和大花黃牡丹的雄蕊瓣化有著類似的基因注釋的功能蛋白。水稻多花的代謝過程中基因不再葉片上表達，該基因被干涉后導致水稻花器官數(shù)量改變，包括雄蕊、外面的穎殼等。同時該基因表達影響多個花器官發(fā)育相關基因的改變。polygalacturonase proteing基因可作為導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的重點。

通過對2個相關基因的比較,Seonghoe Jang等人關于水稻多花的文章中，提出的polygalacturonase proteing基因，是導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的最有可能的基因，接下來的工作，找到大花黃牡丹中該基因進行驗證，確定它是否是導致大花黃牡丹雄蕊瓣化的基因。