孫春玲

(周口市中心血站檢驗科,河南 周口466000)

為保障臨床輸血安全,多年來我國采供血機構(gòu)采用兩種不同廠家酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑對獻血者血液標本進行乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)、丙型肝炎抗體(抗-HCV)、人類免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)等血清學(xué)項目檢測,但由于窗口期感染、病毒核酸變異以及隱匿性感染等因素,使得部分獻血者血液雖經(jīng)血清學(xué)檢測合格后仍然存在感染乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的風(fēng)險[1]。依據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2015)》(國家衛(wèi)生計生委關(guān)于印發(fā)血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)的通知.國衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2015〕95號)要求,自2016年3月1日始我國采供血機構(gòu)對獻血者血液標本全面實施ELISA和核酸檢測(NAT)兩種方法聯(lián)合檢測,以降低經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的風(fēng)險。本文回顧分析64 420例獻血者的實驗室篩查資料,為提高血液質(zhì)量及確保輸血安全提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇周口市中心血站2016年3月至2017年4月采集的無償獻血者血液標本64 420例為研究對象,其中男30 790例,女33 630例,年齡18～60歲,中位年齡32歲；初次獻血39 940例,重復(fù)獻血24 480例。所有獻血者均符合獻血者健康檢查要求[2],均簽署自愿獻血協(xié)議書。

1.2 檢測試劑與儀器

檢測試劑：初檢HBs Ag、抗-HCV、梅毒螺旋體抗體(抗-TP)、抗-HIV ELISA試劑由珠海麗珠生物技術(shù)有限公司提供,復(fù)檢 HBs Ag、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV ELISA試劑由廈門新創(chuàng)生物技術(shù)有限公司提供；初檢、復(fù)檢丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑盒分別由貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)(蘇州)有限公司和上?？迫A生物工程股份有限公司提供；HBV/HCV/HIV三聯(lián)合核酸提取試劑和檢測試劑由上海浩源生物科技有限公司提供。ELISA法和NAT質(zhì)控品均由北京萬泰生物科技有限公司提供。試劑和質(zhì)控品均批批檢合格并在有效期內(nèi)使用。主要血清學(xué)檢測儀器：初檢儀器主要是瑞士RSP 150加樣系統(tǒng)和德國BEPⅢ第三代全自動酶免系統(tǒng),復(fù)檢儀器主要是MF-FA ME24/30全自動酶免系統(tǒng),ALT檢測設(shè)備為貝克曼AU480型全自動生化分析儀。NAT檢測儀器：Chi TaS BSS1200系統(tǒng)、HAMILTON-EZbead系統(tǒng)和ABI7500全自動PCR擴增分析儀。所有檢測設(shè)備均經(jīng)過廠家校驗,且均可良好運行。

1.3 ELISA和NAT檢測方法

1.3.1 標本留取

采集獻血者靜脈血于兩支試管(每管5 mL血樣),1支為EDTAK2抗凝管,用于 HBs Ag、抗-HCV、抗-TP、抗-HIV和ALT血清學(xué)檢測；另1支為含分離膠、無菌、無RNA酶和無DNA酶的真空采血管,用于HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA檢測。標本留取后在2～8℃環(huán)境保存,核酸試管采集血樣后4 h內(nèi)完成離心、分離出血漿并在72 h內(nèi)完成HBV-DNA、HCV-RNA和HIV-RNA檢測。

1.3.2 ELISA 檢測

64 420例無償獻血者標本均使用兩種不同廠家的試劑檢測,每批實驗設(shè)空白對照孔、陰性對照孔、陽性對照孔、室內(nèi)質(zhì)控孔,完成HBs Ag初、復(fù)檢檢測,初檢和復(fù)檢由不同人員操作。結(jié)果判定標準：S/CO(樣本吸光度值/臨界值)≥1.0判為陽性,0.7＜S/CO＜1.0判為灰區(qū),S/CO≤0.7判為陰性。抗-HIV檢測為陽性標本送至周口市疾病預(yù)防控制中心HIV確認實驗室進行確認。

1.3.3 NAT 檢測

將ELISA檢測為陰性的無償獻血者標本,每8個標本混為一個混樣池,且均設(shè)定內(nèi)標對照?；鞓訙y定無反應(yīng)判為陰性,混樣測定有反應(yīng)時予以拆分檢測,拆分后無反應(yīng)者判為陰性,拆分后有反應(yīng)者判為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù),比較采用χ2檢驗,檢驗水準a＝0.05,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)指標檢測結(jié)果

在64 420例獻血者中ALT、HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP血清學(xué)檢測共1362項不合格,其中ALT不合格220項,在以上1362項不合格中,21例存在兩項指標重疊感染,因而共計1341例獻血者血清學(xué)檢測不合格,63 079例獻血者血清學(xué)檢測結(jié)果合格。64 420 例獻血者 HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP檢測結(jié)果見表1。

表1 64 420例獻血者HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP檢測結(jié)果

2.2 血清學(xué)檢測結(jié)果合格獻血者NAT檢測情況

在血清學(xué)檢測均合格的63 079例獻血者中,檢出HBV-DNA陽性57例(0.09%),HIV-RNA陽性1例,未檢出HCV-RNA陽性獻血者。

2.3 HBs Ag(－)/HBV-DNA(＋)獻血員分布情況

在血清學(xué)檢測均合格的63 079例獻血者中,HBV-DNA陽性檢出率男性和女性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；初次獻血與重復(fù)獻血者比較及不同年齡段獻血者比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)。見表2。

表2 63 079例獻血者中HBV-DNA檢測陽性/HBs Ag陰性獻血員分布情況

3 討論

目前輸血及血液制品是臨床疾病治療不可替代的重要措施,多年來,采供血機構(gòu)一直采用血清學(xué)技術(shù)檢測輸血相關(guān)病毒標志物的抗原或抗體,極大地降低了經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎等感染性疾病,但由于試劑靈敏度、窗口期感染、病毒基因變異、免疫靜默、隱匿性感染等諸多因素存在[3],有極少部分獻血者血液雖經(jīng)ELISA法檢測合格,輸注患者后仍然可引起乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病等感染性疾病的傳播。雖然ELISA檢測試劑盒的靈敏度、特異性在不斷提高,但仍相繼有不同文獻報道經(jīng)輸血傳播肝炎、HIV的案例[4-6],給患者的健康造成極大危害。

ELISA法檢測是以抗原、抗體作為檢測對象,曾勁峰等[7]研究顯示,約70%的HCV和90%的HIV、HBV ELISA法漏檢是由窗口期感染引起,此時ELISA法常檢測不出來而造成漏檢,而NAT檢測可將HCV、HBV和HIV的窗口期分別縮短82%(59 d)、20%(9 d)和50%(11 d)。NAT 是一種具有較高特異性和敏感性的免疫學(xué)檢測方法,其通過核酸擴增技術(shù)捕獲獻血者血液標本中較早出現(xiàn)的病毒核酸,可檢出因病毒變異、窗口期感染ELISA法漏檢的標本[8],并且具有操作過程簡便、易于自動化、核酸標本回收率高等優(yōu)勢,適于采供血機構(gòu)對獻血者標本進行大規(guī)模篩查。

本研究中,63 079例經(jīng)血清學(xué)檢測HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV呈陰性獻血者中,應(yīng)用上海浩源Chi Tas 1200核酸檢測篩查出57份(0.09%)HBV-DNA陽性,高于林紅等[9]報道的0.06%陽性率,這可能與本地區(qū)是乙型肝炎的高流行病區(qū)域,自然人群中乙型肝炎的感染率較高有關(guān)。HBV血清轉(zhuǎn)換前窗口期與隱匿性乙肝病毒感染(OBI)獻血者是導(dǎo)致HBs Ag篩查后輸血傳播感染HBV殘余風(fēng)險的主要原因[10]。HBV窗口期感染與隱匿性乙肝病毒感染的獻血者均為血清HBs Ag陰性、HBV-DNA陽性,HBV窗口期感染獻血者HBs Ag會隨著時間推移由陰性轉(zhuǎn)換為陽性,而OBI獻血者其HBs Ag一般不會轉(zhuǎn)換為陽性,通常伴隨抗-HBc陽性,但部分低滴度抗-HBs獻血者中也會存在[11]。河南省是HCV高發(fā)地區(qū),1～75歲自然人群中HCV陽性率高于全國平均水平[12],但本文并未檢出HCV-RNA,這可能與HCV主要感染肝細胞,當肝細胞壞死后方可釋放HCV進入血液中有關(guān)?？贵w產(chǎn)生通常伴隨HCV感染且抗-HCV比較穩(wěn)定,而HCV-RNA在4℃或室溫易被環(huán)境中RNA酶降解,其只有在－20℃以下環(huán)境保存時比較穩(wěn)定,因此HCV-RNA檢測并不能完全代替以往的ELISA篩查,兩種方法互補檢測才能更好地提高血液質(zhì)量。

此外,本研究結(jié)果顯示,在63 079例血清學(xué)檢測合格獻血者中,不同性別獻血者HBV-DNA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),而在不同年齡段分組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),≥49歲年齡段獻血者HBV-DNA陽性率最高(0.26%),18～22歲年齡段獻血者陽性率最低(0.03%),這可能與隨獻血者年齡增長其機體免疫功能逐漸下降相關(guān)[11]；我國自20世紀90年代開始將乙型肝炎疫苗納入新生兒計劃免疫,因而18～22歲年齡段獻血者乙肝疫苗接種率較高,此年齡段獻血者HBV-DNA陽性率較低。重復(fù)獻血人群HBV-DNA陽性率高于初次獻血人群,這可能與低病毒載量的重復(fù)獻血者經(jīng)過多次NAT檢測,增加了HBV-DNA檢出的概率；另外,由于重復(fù)獻血人群長期堅持獻血,這部分獻血者年齡普遍較初次獻血者大,這也與表2中獻血者HBV-DNA陽性檢出率與年齡相關(guān)相映襯。

綜上所述,ELISA篩查獻血者血液標本存在一定的漏檢現(xiàn)象,NAT檢測可有效降低經(jīng)輸血傳播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病的風(fēng)險,從而提高血液質(zhì)量和臨床輸血安全。