羅 倩，李興玉，廖永麗，羅躍梅，陳旭輝，周必英

1.遵義醫(yī)學院 第一臨床學院(遵義563000)；2.遵義醫(yī)學院 寄生蟲學教研室(遵義563000)

陰道毛滴蟲(trichomonasvaginalis,TV)是一種寄生于人體泌尿生殖道的鞭毛蟲，主要寄生于女性的陰道、尿道，男性的尿道、前列腺，引起滴蟲性陰道炎、尿道炎、前列腺炎等，嚴重者可致不育不孕[1-2]。隨著HIV等性傳播疾病的增加，TV感染率亦呈上升趨勢[3]。研究[4-9]報道，我國TV感染率約為6.20%～8.96%。目前，陰道毛滴蟲病已被列為性傳播疾病之一。陰道毛滴蟲病毒(trichomonasvaginalisvirus,TVV)是一種專性寄生于TV內(nèi)的雙鏈RNA病毒。研究[10-11]表明，TVV可影響TV蟲體蛋白的表達，從而降低蟲株的致病力和毒力，同時對甲硝唑治療產(chǎn)生的耐藥性有一定的拮抗作用。為了解遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科門診患者TV及TVV感染情況，本研究對3 321例就診于婦科門診并被送檢陰道分泌物進行TV篩查，并對3 321例女性患者進行了調(diào)查，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年3月至2017年3月于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科門診就診,并被送檢的3 321例陰道分泌物進行TV篩查，并對相應(yīng)的3 321例患者進行問卷調(diào)查。納入標準：1)患者有陰道炎癥狀，如白帶異常、陰道瘙癢等；2)標本存放時間≤20 h；3)患者同意配合調(diào)查。排除標準：1)患者既往明確診斷TV感染并已經(jīng)過藥物治療；2)標本存放時間>20 h；3)標本污染或無法涂片鏡檢；4)患者拒絕調(diào)查。本次調(diào)查共發(fā)放問卷3 321份，回收有效問卷3 321份，有效率100%。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白胨、麥芽糖、L-鹽酸半胱氨酸、青/鏈霉素混合液(雙抗)、瑞氏-姬姆薩復合染液購自北京索萊寶公司；滅活胎牛血清購自北京百奧思科生物科技有限公司；細胞基因組DNA小量提取試劑盒、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Utaq PCR Master Mix購自北京莊盟生物科技有限公司；瓊脂糖為西班牙進口產(chǎn)品；磷鎢酸染液由遵義醫(yī)學院電鏡室配制；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；核酸/蛋白電泳裝置購自北京六一儀器廠；PCR儀購自美國MJ-Research公司。

1.3 方法

1.3.1 TV感染情況調(diào)查 婦科門診醫(yī)生用無菌棉拭子采集3 321例門診患者陰道后穹窿陰道分泌物，將其直接涂布在加有生理鹽水的載玻片或涂片進行染色，鏡檢查TV滋養(yǎng)體。并根據(jù)年齡、職業(yè)、衛(wèi)生習慣等感染因素對患者進行問卷調(diào)查。

1.3.2 TVV感染情況調(diào)查 為了解TVV感染情況，需進一步建立TVV純培養(yǎng)體系。按文獻[12]方法制作肝浸湯培養(yǎng)基，略作如下改進：使用1% NaOH溶液調(diào)pH至5.83，4 mL/每管進行分裝，使用前將培養(yǎng)基置于37 ℃ 30 min，再加入 1 mL滅活血清和50 L雙抗。將上述所得TV陽性株接種于新鮮培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)。每日取1滴于顯微鏡下觀察蟲體數(shù)量及生長狀況，約每72 h傳代1次，連續(xù)培養(yǎng)3代。

取1滴培養(yǎng)液于載玻片上，光鏡下觀察滋養(yǎng)體的活動情況。然后將培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液吸取2 mL于離心管中，1 500 r/min離心10 min，棄掉上清，吸取沉淀于載玻片上均勻涂開，自然干燥后甲醇固定10～15 min。滴加瑞-姬染液將涂片完全覆蓋，染色1 min后滴加等量PBS(pH 7.35～7.45)，混勻后染1～2 min，沖洗,干燥，光鏡觀察。

根據(jù)已發(fā)表的TVV基因序列(U08999),設(shè)計上游引物為5'-ACCGTTTCCACGACCCAG-3'；下游引物為5'-TGTGAAGTCCAGCCAAGC-3'，引物由南京鐘鼎生物公司合成。參照細胞基因組DNA小量提取試劑盒以及第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法提取TV總核酸并得到TVVcDNA：取提取到的TV總核酸5 L,加入RT Enzyne Mix 3 L,RT Reaction 7 L，再用ddH2O調(diào)整總體積至20 L，45 ℃孵育50 min，70 ℃ 15 min后置冰上冷卻，即得cDNA。然后以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：cDNA 3 L,2×Utaq PCR Master Mix 25 L，上下游引物各5 L(2 pmol/ L)，ddH2O 12 L；反應(yīng)條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)擴增30次，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對初步篩選到的攜病毒株，2 000 r/min離心10 min，收集蟲體，送至遵義醫(yī)學院電鏡室，用1%磷鎢酸負染色，透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析和處理數(shù)據(jù)，定性資料采用例數(shù)(%)描述，組間比較采用2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準ɑ 除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 TV感染率及不同年齡患者TV感染情況

3 321例研究對象中，感染TV 76例，檢出率為2.29%?；颊咧饕Y狀為外陰瘙癢、灼熱，白帶增多、呈泡沫狀或膿性，外陰疼痛、性交痛等。不同年齡組患者陰道毛滴蟲感染情況中，30～39歲組檢出率最高，為4.16%(39/937)，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(2=26.568，P<0.001)(表1)。

表1 不同年齡組人群的TV感染分布情況

2.2 不同職業(yè)患者TV感染情況

將患者分為農(nóng)民、工人、機關(guān)事業(yè)、其他4類職業(yè)，其中農(nóng)民檢出率最高，為3.60%(34/945)；其次為工人，檢出率為2.57%(25/973)；機關(guān)事業(yè)單位和其他檢出率均為1.21，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(2=14.612，P<0.05)(表2)。

表2 不同職業(yè)人群TV感染分布

2.3 不同衛(wèi)生習慣及性傳播知識了解程度人群TV感染情況

從不用專用盆和毛巾清洗外陰的人群以及內(nèi)外衣褲從不分開洗的人群檢出率相對較高，分別為3.45%(38/1 103)和3.22%(39/1 210)，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(2分別為14.280,11.624，P<0.05)。經(jīng)常了解性傳播疾病知識的人群檢出率相對較少，為1.34%(14/1 046)，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(2=9.631，P<0.05)(表3)。

表3 不同衛(wèi)生習慣及性傳播知識了解程度人群TV感染分布

2.4 TV的培養(yǎng)與形態(tài)觀察

光鏡下可見蟲體呈無色透明，有折光性(圖1)。蟲體活動力強，可呈圓形或橢圓形，借助鞭毛擺動旋轉(zhuǎn)前進，偶見蟲體聚集成團。瑞-姬復合染色后蟲體顯紫藍色，核呈深藍色，蟲體呈圓形或橢圓形，鞭毛顯紫紅色，4根前鞭毛以及軸柱伸出體外，內(nèi)部結(jié)構(gòu)尚不清楚(圖2)。光鏡下觀察到蟲體，說明培養(yǎng)成功。共取得蟲株76株，培養(yǎng)成功58株。

2.5 TV攜病毒株的篩選

對從TV滋養(yǎng)體提取的總核酸進行電泳以及RT-PCR擴增，電泳圖譜均未出現(xiàn)TVV目的基因條帶，結(jié)合電鏡亦未找到病毒顆粒。

圖1 TV滋養(yǎng)體(未染色)20×

圖2 TV滋養(yǎng)體(瑞-姬染色)100×注：A：深藍色核；B：伸出體外的4條前鞭毛和1條軸柱；C、D：橢圓形或圓形TV滋養(yǎng)體

3 討論

TV是一種引起人體泌尿生殖道感染的病原體，主要通過直接或間接接觸傳播。女性TV感染主要表現(xiàn)為外陰瘙癢、灼熱感、泡沫狀白帶，男性主要表現(xiàn)為尿道炎或無癥狀帶蟲狀態(tài)[13-14]。TV還可使小鼠成為帶蟲者，某些靈長類動物如猴感染TV后也可出現(xiàn)臨床癥狀[15-16]。TV感染呈世界性分布，在我國亦有較高的感染率，其中已婚女性較未婚女性顯著增高，中年女性感染相對較多，不同職業(yè)亦對感染率有一定影響，個人衛(wèi)生較差也會導致感染率增高。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016年3月至2017年3月遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科門診患者TV檢出率約為2.29%，TV感染多集中在中年期女性，即30～49歲檢出率相對較高，可能與此年齡段人體性機能比較旺盛有關(guān)。從職業(yè)分布來看，農(nóng)民的檢出率最高，其次為工人，可能與人群綜合素質(zhì)較低且職業(yè)環(huán)境較差有關(guān)，大部分農(nóng)民和工人文化水平較低下，衛(wèi)生保健意識相對薄弱，經(jīng)常忽略自己的身體情況，從而導致感染率增加。不良衛(wèi)生習慣以及月經(jīng)期間陰道pH升高亦會導致TV繁殖增多，因此，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習慣，保持內(nèi)衣內(nèi)褲等貼身衣物的清潔以及注意經(jīng)期衛(wèi)生有利于降低TV的感染率。此外，普及醫(yī)療保健知識，加強性傳播知識的宣傳教育，增強衛(wèi)生保健意識，定期進行健康體檢，亦有利于降低TV感染率。

本研究采用肝浸湯培養(yǎng)基建立TVV純培養(yǎng)體系，關(guān)于培養(yǎng)基合適的pH值，國內(nèi)學者認為在5.2～6.6[17-19]，本研究經(jīng)過反復多次摸索后發(fā)現(xiàn)，pH在5.83左右的環(huán)境下，蟲體數(shù)量多，生長快速且活躍，生存時間也較長，少數(shù)可達5～6 d。同時采用瑞-姬復合染液對TV滋養(yǎng)體進行形態(tài)學鑒定，染色后蟲體輪廓清晰，但內(nèi)部結(jié)構(gòu)尚不清楚，需進一步探索更好的染色方法。

1986年，Wang等[20]在純化的TV核酸中發(fā)現(xiàn)約5.5 kb的核酸電泳帶后，進一步采用分子生物學方法確定TV中存在dsRNA病毒，并命名為TVV。電鏡下TVV直徑大小為33～200 nm，可呈球形、絲狀或圓柱狀，主要分布在胞質(zhì)中高電子密度核心、低電子密度中央部分和外周，細胞核內(nèi)較少見[21]。趙月平等[22-24]在我國TV長春株中分離到TVV，電鏡下形態(tài)與國外結(jié)果一致，并對部分基因進行克隆分析，這是國內(nèi)首次成功克隆出TVV RDRP基因序列。王麗娟等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)TVV的寄生會對TV的基因多態(tài)性產(chǎn)生影響，且無病毒寄生的蟲體易發(fā)生耐藥。TVV在不同地區(qū)感染率不同，菲律賓為19%[27]，韓國為14%[28]，德黑蘭為50%[29]，我國河南地區(qū)為20%[26]。本研究并未找到TV攜病毒株，分析可能與以下因素有關(guān)：1)TV的體外培養(yǎng)體系可能對TVV生長有一定影響。有TVV寄生的TV經(jīng)過長期體外培養(yǎng)后會導致TVV減少，其原因需進一步研究；2)仍未成功建立TVV體外純培養(yǎng)體系,需進一步摸索TVV的純培養(yǎng)條件；3)此次調(diào)查樣本量較少，TV僅培養(yǎng)成功58株，需進一步擴大樣本量提高TVV的檢測率；4)電鏡標本處理時，未進行離心純化，為此次研究的疏漏，需進一步完善；5)或是由于不同地區(qū)蟲株差異或病毒差異所致等。具體原因還需進一步探索。

綜上所述，TV可嚴重危害女性身體健康，TV感染與自身潔陰習慣、環(huán)境衛(wèi)生條件、經(jīng)濟水平、防病知識了解水平等息息相關(guān)。只有通過養(yǎng)成良好衛(wèi)生習慣、加強性傳播知識的普及才能減少TV傳播，降低患病風險。關(guān)于TVV的培養(yǎng)條件及篩選仍有待進一步提高。