張奇瑜，鄢騎兵

1.成都醫(yī)學院 生物科學與技術學院(成都610500)；2.金堂縣第一人民醫(yī)院 檢驗科 (金堂 610400)

結腸癌(colorectal cancer，CRC)是我國常見的惡性腫瘤[1]。40%～50%的CRC患者會發(fā)生腫瘤轉移，其5年期生存率低于10%[2]。長期炎性環(huán)境是CRC發(fā)生的一個重要病因。傳統(tǒng)的化療和放療已不能有效地治療癌癥，而且副作用較大。目前，臨床研究[3-5]表明，天然化合物能有效治療癌癥。辣椒堿是辣椒中的主要活性成分[6]，長期食用易導致腸炎，適量濃度的辣椒堿能促進一系列炎癥因子的高表達，具有抗凋亡和促進血管生成等重要作用。本課題組前期研究[7]結果證明，低濃度辣椒堿能促進CRC細胞轉移。有研究[8]報道，炎癥是癌癥轉移的重要驅動力。本課題擬從NLRP3炎性小體是否參與辣椒堿促進CRC轉移，明確炎性相關通路在辣椒堿誘發(fā)CRC轉移的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人CRC細胞 SW480、HCT116 (中國科學院細胞庫)。

1.1.2 試劑 辣椒堿 (純度>99%)(美國sigma公司)，酶聯(lián)免疫檢測試劑盒( 武漢華美生物工程有限公司)，NAC(美國sigma公司)，MCC950(美國MCE公司)，NLRP3、E-cadherin、Vimentin、β-actin單克隆抗體、兔二抗、鼠二抗、羊二抗均購自cell signaling technology公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SW480 和 HCT116 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含105U/L青霉素，100 mg/L 鏈霉素)中，于37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用 100 μM 辣椒堿處理CRC SW480細胞和 12.5 μM 辣椒堿處理 HCT116 細胞 48 h。使用NLRP3的特異性抑制劑 1 μM MCC950， ROS抑制劑 1 M N-乙酰半胱氨酸( NAC)分別與辣椒堿共同處理結腸癌細胞 48 h。

1.2.2 酶聯(lián)免疫 參考試劑盒方法，將細胞培養(yǎng)上清取100 uL加入已包被好的ELISA板中，37 ℃孵育2 h，用洗滌緩沖液洗板3次， 30 s/次。再加入生物素化的一抗，37 ℃孵育1 h，洗板3次，30 s/次。再加入HRP標記的的二抗，37 ℃孵育0.5 h，洗板5次，30 s/次。最后加入TMB顯色劑，顯色15～30 min，加入終止液終止，于酶標儀中450 nm波長下讀數(shù)。

1.2.3 細胞遷移分析(Transwell)法 將2.5×104個細胞接種于Transwell小室中，小室內加入辣椒堿或與MCC950的混合液，處理上室中的CRC細胞48 h后，結晶紫染色測定遷移的細胞個數(shù)。

1.2.4 免疫印跡 參考文獻[9]方法，收集經(jīng)藥物處理后的細胞，按1×106細胞濃度加入100 μL細胞裂解液，震蕩，冰上放置1 h，4 ℃，13 000 g離心力下，離心15 min，轉移蛋白樣品到新EP管中，經(jīng)BCA試劑盒定量后，加入5×上樣緩沖液，混勻，100 ℃加熱變性5 min。通過12 % SDS-PAGE電泳分離后，轉膜至PVDF膜上。分別加入一抗(一抗稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜后，辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶6 000)37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌PVDF膜5次， 10 min/次，加入ECL顯影劑后，通過X光膠片曝光。

1.2.5 活性氧ROS檢測 參考試劑盒方法，按照1∶1 000用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μM。將經(jīng)辣椒堿處理后的細胞，懸浮于稀釋好的 DCFH-DA液中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育30 min。用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 辣椒堿促進CRC細胞炎性因子釋放

為了探究炎癥在辣椒堿促進CRC細胞轉移中發(fā)揮的作用，檢測了經(jīng)處理后的CRC細胞培養(yǎng)液中炎性因子的變化。采用辣椒堿處理CRC細胞SW480和HCT116后，通過ELISA 檢測IL-1β、IL-6及TNF-α的表達量，發(fā)現(xiàn)3者均明顯升高(圖 1)。

圖 1 ELISA法檢測炎性因子的釋放±s)

注：A：采用ELISA法檢測100 μM辣椒堿處理SW480細胞后，細胞上清中炎性因子分泌量的變化；B：采用ELISA法檢測12.5 μM辣椒堿處理HCT116細胞后，細胞上清中炎性因子分泌量的變化。與對照組比較，**P<0.01

2.2 辣椒堿通過激活NLRP3炎性小體進而誘導CRC細胞轉移

NLRP3炎性小體是炎癥中最經(jīng)典的調控元件。為了驗證NLRP3在辣椒堿誘導的CRC炎癥反應中是否被激活，Western Blot法檢測辣椒堿單獨處理后，CRC細胞SW480和 HCT116中NLRP3的表達水平，結果表明NLRP3炎性小體被激活，同時E-cadherin蛋白水平下調、Vimentin蛋白水平上調。為進一步明確NLRP3炎癥小體參與辣椒堿誘發(fā)的CRC轉移過程，本研究采用NLRP3特異性抑制劑MCC950單獨或者與辣椒堿共同處理細胞，用Transwell法檢測辣椒堿對CRC細胞遷移能力的影響。并用ELISA法檢測到用抑制劑處理后炎性因子釋放量減少(圖2),Transwell 實驗檢測到MCC950能抑制辣椒堿對CRC轉移的促進作用(圖3)，并且Western Blot檢測結果顯示，MCC950和辣椒堿共處理細胞后，E-cadherin蛋白水平上調、Vimentin蛋白水平下調(圖4)。以上實驗結果表明，辣椒堿依賴于NLRP3炎性小體的活化進而誘導結腸癌細胞轉移。

圖2 ELISA法檢測炎性因子的釋放±s)

注：A：采用ELISA法檢測100 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理SW480細胞后，細胞上清中炎性因子分泌量的變化；B：采用ELISA法檢測12.5 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理HCT116細胞后，細胞上清中炎性因子分泌量的變化。與對照組比較，**P<0.01； 與辣椒堿處理組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 Tanswell法檢測細胞的遷移能力

圖4 Western Blot檢測NLRP3和EMT相關標志性蛋白

注：A：采用Western blot法檢測100 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理SW480細胞后，EMT相關標志性蛋白的變化；B：采用Western blot法檢測12.5 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理HCT116細胞后，EMT相關標志性蛋白的變化

2.3 辣椒堿通過增加胞內 ROS 的表達水平來激活NLRP3炎性小體

據(jù)文獻[10-11]報道，在CRC細胞發(fā)生炎癥反應時，胞內ROS能明顯增加NLRP3的表達量。 在前期研究[7]中，發(fā)現(xiàn)CRC細胞經(jīng)辣椒堿處理后，細胞內ROS水平明顯上調。為了驗證辣椒堿是否通過上調胞內ROS水平來誘發(fā)炎癥反應，本研究用辣椒堿和NAC共處理CRC細胞，發(fā)現(xiàn)辣椒堿處理后的細胞，胞內ROS 的表達量明顯增加，而NAC能明顯逆轉辣椒堿誘發(fā)的ROS含量和NLRP3表達量的上升( 圖5～6)。以上結果表明，辣椒堿通過上調胞內ROS 的表達水平來激活NLRP3炎性小體，誘發(fā)炎癥反應進而促進其轉移。

圖5 流式細胞儀檢測ROS 的表達水平±s)

注：A：采用流式細胞術檢測100 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理SW480細胞后，胞內ROS含量的變化；B：采用流式細胞術檢測12.5 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理HCT116細胞后，胞內ROS含量的變化。與對照組比較，*P<0.05；與辣椒堿處理組比較，*P<0.05

圖6 Western Blot檢測NLRP3的表達水平

注：A：采用Western blot法檢測100 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理SW480細胞后，NLRP3蛋白水平的變化；B：采用Western blot法檢測12.5 μM辣椒堿單獨處理或與MCC950共處理HCT116細胞后，NLRP3蛋白水平的變化

3 討論

CRC是全世界最常見的惡性腫瘤之一,在我國其發(fā)病率居惡性腫瘤的第 3 位。而腫瘤轉移是癌癥復發(fā)的主要原因。早有研究[12-15]報道，上皮間質轉化(EMT)是腫瘤轉移的先驅事件，它是表皮細胞轉變?yōu)殚g質細胞的過程。其中，EMT 發(fā)生的重要分子變化就是E-cadherin蛋白的減少和Vimentin 蛋白的增加。本課題組前期研究[7]證明，低濃度辣椒堿能誘導CRC細胞發(fā)生EMT，進而促進CRC轉移，但辣椒堿誘導EMT發(fā)生的具體分子機制仍需進一步研究。

炎癥是惡性腫瘤轉移的主要驅動力，并且腫瘤相關炎性能促進EMT進程，而腫瘤炎癥微環(huán)境增強了腫瘤的侵襲和轉移能力[16]。NLRP3炎性小體是主要的炎癥調控元件，據(jù)文獻[17]報道，炎性小體在炎癥驅使的腫瘤發(fā)展中起著重要的作用，如CRC。本研究發(fā)現(xiàn)，在用辣椒堿處理CRC細胞后，NLRP3蛋白量明顯上調。而用NLRP3的特異性抑制劑MCC950處理細胞，則能解除辣椒堿的促轉移作用。結果證明，辣椒堿是通過激活NLRP3炎性小體來誘發(fā)炎癥反應，從而促進CRC細胞的轉移。

另有文獻[18-19]報道，氧化應激能夠加快腫瘤細胞死亡達到腫瘤治療的目的， 作為機體發(fā)生氧化應激反應產(chǎn)生的主要分子，活性氧( ROS)主要是通過誘導細胞凋亡、壞死及自噬性死亡近而抑制癌癥發(fā)展。在本研究中，發(fā)現(xiàn)辣椒堿能促進CRC細胞內ROS的增加，而加入NAC能逆轉辣椒堿誘導的ROS上升，并且能阻斷辣椒堿的促轉移作用，說明ROS在辣椒堿介導的CRC轉移中發(fā)揮了關鍵性作用，但辣椒堿誘導ROS產(chǎn)生的分子機制尚存在疑惑，需更深層次的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)辣椒堿能誘導ROS產(chǎn)生進而激活NLRP3炎性小體，從而誘導CRC細胞發(fā)生EMT并促進CRC轉移。本研究為CRC的預防及癌癥患者的清淡飲食習慣提供了理論依據(jù)。