杜 昕，譚明證，代富英，潘 渠

成都醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室(成都 610500)

乳桿菌屬(Lactobacillus)能利用多種碳水化合物產(chǎn)生乳酸，為安全無害的微生物[1]。乳桿菌常見于植物體表、傳統(tǒng)發(fā)酵食品、乳制品、人和動物腸道中。它們常常作為益生菌廣泛應(yīng)用于維持腸道菌群平衡，治療腸道和心理疾病[2-4]。

新的乳桿菌種仍在不斷被發(fā)現(xiàn)。2017年，Afouda等[5-7]發(fā)現(xiàn)了9種新的乳桿菌。筆者在重慶農(nóng)家自制泡姜中發(fā)現(xiàn)了乳桿菌CQ16Z1菌株。通過分子鑒定和生化表型測定，CQ16Z1菌株被鑒定為福菜乳桿菌(Lactobacillusfutsaii) 。福菜乳桿菌是2012年在臺灣苗栗縣傳統(tǒng)客家菜福菜中發(fā)現(xiàn)的乳桿菌新種，模式種為YM0097T (=JCM17355T=BCRC80278T)[8]。后來在泰國傳統(tǒng)發(fā)酵食品(Kung-Som) 中也發(fā)現(xiàn)了該菌[9]。本研究鑒定了福菜乳桿菌CQ16Z1菌株并對其益生特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株CQ16Z1分離自重慶農(nóng)家自制泡菜，福菜乳桿菌模式菌株JCM17355T購自臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所。大腸桿菌E57為筆者實(shí)驗(yàn)室保存。人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29購自成都尚博生物試劑有限公司。API 50 CHL購自成都古蒙生物科技有限公司。革蘭陽性菌基因組提取試劑盒、PCR(Ex Taq)和T載體試劑盒購自大連寶生物公司(TaKaRa)。異硫氰酸熒光素(FITC)購自索萊寶公司。細(xì)菌微量生化管購自杭州賓和微生物試劑有限公司。試驗(yàn)采用的主要儀器有：核酸電泳儀(美國 Bio-Rad)、離心機(jī)(Thermo scientific)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad)、生物安全柜(Thermo scientific 1300 series A2)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific)、倒置顯微鏡(Olympus)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)和酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征觀察 菌株在經(jīng)過細(xì)菌處理和固定、乙醇梯度脫水、CO2臨界點(diǎn)干燥后上電鏡，于掃描電子顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征[10]。

1.2.2 生長特性的測定 以2 %(v/v)的接種量將菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中， 37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每2 h用酶標(biāo)儀在600 nm處測一次培養(yǎng)物的吸光度。

1.2.3 生理生化特征 對經(jīng)過37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h的菌株進(jìn)行明膠液化、硝酸鹽產(chǎn)氣、過氧化氫酶、硫化氫試驗(yàn)及乳桿菌碳源利用能力的測定(采用API 50 CHL試劑盒)，以福菜乳桿菌模式菌株JCM17355T為對照。

1.2.4 分子鑒定 采用熱變性溫度法(thermal denaturation temperature,Tm)測定G+C含量(mol%)[11]。 采用復(fù)性速率檢測方法對福菜乳桿菌模式菌株JCM17355T與本試驗(yàn)菌株CQ16Z1進(jìn)行DNA-DNA雜交試驗(yàn)[12-13]。菌株CQ16Z1的總DNA用革蘭陽性菌基因組提取試劑盒提取。采用引物對(正義：5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’; 反義：5’-AAGGAGGTGATCCAGC CGCA-3’)擴(kuò)增其16S rDNA序列。反應(yīng)體系：16S rRNA基因通用引物(正義)1 μL、16S rRNA基因通用引物(反義)1 μL、CQ16Z1基因組0.5 μL、Premix ExTaq 10 μL、滅菌水補(bǔ)足體系共20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min一個(gè)循環(huán)。95 ℃，40 s；55 ℃，30 s；72 ℃，125 s；25個(gè)循環(huán)。最終72 ℃，10 min。用膠回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，然后進(jìn)行T-A 克隆，擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，最后利用NCBI網(wǎng)站上的序列比對工具BLAST，在 GenBank數(shù)據(jù)庫中比對測序結(jié)果。

1.2.5 耐酸試驗(yàn) MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在不同pH值(3.0、4.5、6.0、8.5)下，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h，考察菌株對不同pH的耐受性。

1.2.6 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 以4.0 %(V/V)的接種量將菌株CQ16Z1接種于分別含膽酸鈉、?；鞘懰徕c、脫氧膽酸鈉、禽膽鹽和牛磺鵝脫氧膽酸鈉的MRS培養(yǎng)基中，膽酸鹽濃度設(shè)為(0.03%、0.06 %、0.08 %、0.15 %、0.20 %、0.30 %、0.40 %)，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.7 細(xì)胞黏附能力 以人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29作為體外模型，大腸桿菌E57為對照，研究菌株CQ16Z1的黏附性能[14-15]。實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：收集培養(yǎng)好的菌體，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，和HT-29細(xì)胞孵育1 h，洗去沒有黏附的細(xì)菌，用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞懸液熒光。

2 結(jié)果

2.1 菌株CQ16Z1 形態(tài)特征

菌株CQ16Z1的形態(tài)呈長桿狀，大小為0.5～0.6 μm × 2.2～4.6 μm，符合乳桿菌屬形態(tài)特征(圖1)。

圖1 菌株CQ16Z1掃描電鏡照片

2.2 菌株CQ16Z1 的生長特性

菌株CQ16Z1 培養(yǎng)2 h后的OD(吸光度)值較小，其遲緩期應(yīng)為2 h； 4 h后培養(yǎng)物OD值開始顯著升高， 18～36 h，培養(yǎng)物OD值變化緩慢(圖2)。生長曲線顯示菌株CQ16Z1具備遲緩期短且生長快的特性，有利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

圖2 菌株CQ16Z1的生長曲線

2.3 CQ16Z1 生理生化特征

菌株CQ16Z1的明膠液化、過氧化氫酶、硫化氫、吲哚和硝酸鹽利用實(shí)驗(yàn)都為陰性，符合乳桿菌屬特征。API 50 CHL實(shí)驗(yàn)(49個(gè)碳源)結(jié)果表明，CQ16Z1和親緣性最近的福菜乳桿菌 JCM17355T菌株在利用葡萄酸鹽、半乳糖和核糖上不同。相較于CQ16Z1的弱利用，福菜乳桿菌 JCM17355T卻是不能利用。CQ16Z1應(yīng)該鑒定為福菜乳桿菌。菌株CQ16Z1具有利用半乳糖和纖維二糖的能力，是有價(jià)值的益生菌特征。

2.4 菌株CQ16Z1的分子鑒定

菌株CQ16Z1 基因組的G+C mol %是39.1 %，在乳桿菌屬G+C mol %的范圍中(32%～53 %)；其16S rDNA擴(kuò)增片段長度為1 559 bp，GenBank數(shù)據(jù)庫編號為：KY242444。BLAST比對結(jié)果表明：福菜乳桿菌 JCM17355T菌株的16S rDNA (NR_117973)是與擴(kuò)增片段最相似的序列，相似值為99.87 %。菌株CQ16Z1與福菜乳桿菌 JCM17355T菌株的DNA-DNA雜交同源性為91.9%。據(jù)此將CQ16Z1鑒定為福菜乳桿菌。

2.5 菌株CQ16Z1的耐酸實(shí)驗(yàn)

乳桿菌一般可生長于pH≤5.0的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)表明菌株CQ16Z1不能在pH 3.0條件下生長，但可以在pH 4.5～8.5生長。

2.6 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株CQ16Z1對不同的膽鹽都有不同程度的耐受性。最高耐受濃度分別為：0.08 %的膽酸鈉和禽膽鹽、0.15 %的脫氧膽酸鈉和?；蛆Z脫氧膽酸鈉、以及0.4 %的牛磺石膽酸鈉(表1)。

表1 膽鹽耐受結(jié)果

2.7 菌株CQ16Z1對HT-29細(xì)胞的黏附

菌株CQ16Z1對 HT-29細(xì)胞具有很強(qiáng)的黏附能力，黏附率高達(dá)85.7 %，條件致病菌大腸桿菌E57的黏附率為57.7 %。

3 討論

通過對菌株CQ16Z1進(jìn)行的多相分類鑒定發(fā)現(xiàn)，該菌株符合乳桿菌屬特征，如菌體為長桿狀，不產(chǎn)生過氧化氫酶、硫化氫和吲哚，不液化明膠及G+C mol%為39.1%。且16S rRNA基因序列比對、DNA-DNA雜交和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果均支持CQ16Z1菌株歸屬于福菜乳桿菌。故命名為福菜乳桿菌CQ16Z1菌株。通常認(rèn)為DNA-DNA雜交值>70 %為同一個(gè)種,>79 %為相同亞種[16]。然而在實(shí)際報(bào)道的亞種之中，有些亞種和模式種之間DNA-DNA雜交值是>79 %的，例如，蕓苔假單胞菌新亞種(Pseudomonasbrassicacearumsubsp.neoaurantiaca)和模式種之間的DNA-DNA雜交值是90.0 %[17]，德氏乳桿菌的保加利亞亞種(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus)和孫氏亞種(L.delbrueckiisubsp.Sunkii)之間雜交值為91.6%[18]，而德氏乳桿菌的印度亞種(L.delbrueckiisubsp.indicus)和雅克布森亞種(L.delbrueckiisubsp.Jakobsenii)之間雜交值更是達(dá)到了為99.0%[19]。本研究CQ16Z1菌株和福菜乳桿菌之間的DNA-DNA雜交值是91.9 %，仍有可能是福菜乳桿菌的新亞種。

益生菌具備益生特性，首先其能耐受腸道環(huán)境，其次是其必須具備定植在腸道的能力。本研究耐酸實(shí)驗(yàn)顯示，菌株CQ16Z1可在pH 4.5的酸性環(huán)境中生長，提示其可通過胃的酸性環(huán)境到達(dá)腸道。且在API 50 CHL試驗(yàn)中可知，菌株CQ16Z1具有利用半乳糖和纖維二糖的能力，是有價(jià)值的益生菌特征。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌株CQ16Z1耐膽鹽并對小腸上皮細(xì)胞HT-29具有很強(qiáng)的黏附能力，遠(yuǎn)高于大腸桿菌E57的黏附率，說明其具備益生特性。該菌株的鑒定及益生特性的研究不僅增加了乳桿菌的種質(zhì)資源，也為其應(yīng)用開發(fā)打下了基礎(chǔ)。