董 昊，包彥強(qiáng)，韓鵬虎，蔣志悅，韓麗琴

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外的一類大分子物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗癌等作用[1-2]。化學(xué)基團(tuán)的引入可以明顯改善多糖的溶解度[3]，常常會增強(qiáng)多糖的活性或使多糖產(chǎn)生新的活性[4-5]。硫酸酯化多糖是指多糖中的羥基被硫酸基所取代，從而發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，具有更強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等作用[6]。白參菌，又名裂褶菌、白花，是一種食藥兼用的珍稀菇菌。白參菌富含鋅、鐵、鉀、鈣、磷、硒、鍺，而且有較高的藥用價(jià)值，能防治神經(jīng)衰弱、清肝明目、健胃、潤肺、抗癌、抗炎癥[7]。白參菌多糖是白參菌發(fā)揮作用的主要有效成分之一。白參菌多糖能顯著抑制腫瘤生長，使化療后引起的白細(xì)胞下降得到較快回升;可恢復(fù)老年動物細(xì)胞免疫及體液免疫的功能，對延緩衰老也可能有一定意義[8-9]。本研究采用均勻?qū)嶒?yàn)分析方法，從而得到白參菌多糖硫酸酯化的最佳修飾條件，為進(jìn)一步研究其功能與生理活性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

白參菌多糖(自制)，無水乙醇，硫酸，氨基磺酸，二甲基亞砜，乙二胺四乙酸二鈉，其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

儀器JB-3定時(shí)恒溫磁力攪拌器；FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；800電動離心機(jī)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)；Verterx70型傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 多糖的修飾

取一定量純化的白參菌多糖于三頸燒瓶中，加入甲酰胺，攪拌使其完全溶解，加入適量的氨基磺酸，在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)，然后用10%NaOH調(diào)pH至7.0～8.0，加入3倍量的95%乙醇醇沉24 h，離心，收集沉淀，沉淀復(fù)溶，用3500的透析袋透析72 h，再對透析液進(jìn)行濃縮，冷凍干燥，即得硫酸酯化修飾后的白參菌多糖[10]。多糖修飾后取代度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[10]。

1.3 多糖修飾后取代度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)硫酸鈉溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL,于具塞試管中，以1 mol/L的鹽酸溶液補(bǔ)至0.20 mL,用0.20 mL的鹽酸溶液作為空白，分別加入三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇-明膠溶液1.0 mL，搖勻靜置15 min(室溫)。于360 nm波長處，測得吸光度A1，再以1.0 mL的明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液，測吸光度A2，以硫酸基濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度(A1-A2)為縱坐標(biāo)繪圖[11]。

1.4 樣品取代度的測定

準(zhǔn)確稱取10 mL修飾后的多糖，加入到50 mL容量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液，于100 ℃下反應(yīng)3 h后終止反應(yīng)。用1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL，搖勻，離心取上清液，測定硫酸根的含量。白參菌多糖的硫酸根取代度的計(jì)算公式為[12]:

DS=1.62S/(32-1.02S)

1.5 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)U10(53)來安排實(shí)驗(yàn)，考察溫度、時(shí)間、投料比(氨基磺酸質(zhì)量/多糖質(zhì)量)5個(gè)因素對硫酸基取代度的影響，每個(gè)因素取5個(gè)水平，優(yōu)化白參菌多糖硫酸酯化具體條件見表1[13]。

表 1 因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾前后多糖紅外光譜圖的比較

白參菌多糖修飾前后的紅外光譜如圖1、2所示，多糖在3200～3500 cm-1的寬峰是O-H伸縮振動；2900 cm-1左右的吸收峰為糖類C-H伸縮振動；1000～1200 cm-1的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動所引起的；糖環(huán)形態(tài)為吡喃糖環(huán)[14-15]。修飾后的白參菌多糖，其中3200～3500 cm-1的吸收峰為多糖中-OH的吸收峰的變窄，說明羥基數(shù)量有所減少。在1700 cm-1附近有一明顯的吸收峰,該峰-OSO3的S=O伸縮振動吸收峰,這表明硫酸中的硫酸基已被轉(zhuǎn)移到了白參菌多糖中，形成了新的化學(xué)鍵。

圖 1 白參菌多糖的紅外光譜圖

圖 2 硫酸酯化白參菌紅外光譜圖

2.2 均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果及分析

白參菌多糖修飾均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果見表2,數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表3。

表2數(shù)據(jù)采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)處理軟件DPS8.0進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析[16]得到擬合方程：

Y=-25.193 5-0.624 5×X1+8.788 1×X2+

0.124 2×X1×X2-0.066 7×X1×X3

式中Y為硫酸根取代度，X1為反應(yīng)溫度，X2為反應(yīng)時(shí)間，X3為投料比。

擬合方程的P=0.002，方程有顯著意義；剩余標(biāo)準(zhǔn)殘差SSE=0.009 4，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)R為0.998 7。從表3可以看出時(shí)間和投料比與硫酸根的取代度成正相關(guān)，而溫度則成負(fù)相關(guān)。因此，在實(shí)驗(yàn)中可以增加反應(yīng)時(shí)間，增大投料比，降低反應(yīng)溫度，以使硫酸根的取代度達(dá)到最大。

根據(jù)回歸方程，得到的最優(yōu)組合為反應(yīng)溫度50.2 ℃，反應(yīng)時(shí)間2.18 h，投料比為2.15∶1。

表 2 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表 3 二次多項(xiàng)式逐步回歸數(shù)據(jù)處理結(jié)果

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

在反應(yīng)溫度50.2 ℃、反應(yīng)時(shí)間2.18 h、投料比為2.15∶1的條件下，稱取干燥至恒重的白參菌多糖3份各2.0 g，平行進(jìn)行3次酯化操作，得到3份硫酸酯化的白參菌多糖，其取代度分別為0.453、0.460、0.458，與均勻設(shè)計(jì)結(jié)果的差異不顯著。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說明均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方法篩選的白參菌多糖硫酸酯化工藝可靠、穩(wěn)定。

3 討 論

采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析方法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，能通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)囊括較多的實(shí)驗(yàn)因素，利用軟件進(jìn)行回歸分析，提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，確定了最佳修飾條件，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)更加表明均勻?qū)嶒?yàn)?zāi)茌^好地?cái)M合反應(yīng)體系。

采用氨基磺酸法進(jìn)行白參菌多糖的硫酸酯化修飾，相比于其他實(shí)驗(yàn)方法毒性更小，而且反應(yīng)條件溫和，便于控制反應(yīng)過程，取得與其他方法相似的取代度[15,17]，說明該方法的實(shí)用性較好，可行性較高。