魏江，于洋，羅光華，張俊，徐寧，張曉膺（.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室，江蘇常州3003；.瑞典Lund大學(xué)臨床化學(xué)系S-85）

載脂蛋白M（ApoM）主要存在于高密度脂蛋白（HDL）中，少部分存在于低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白中[1]。其有8股反向β折疊片段，從而形成疏水性結(jié)合域，這樣就與一些親脂小蛋白分子結(jié)合，如視黃醇、肉豆蔻酸及1-磷酸鞘氨醇（S1P），從而發(fā)揮相應(yīng)作用。ApoM能促進(jìn)前β-HDL顆粒形成及成熟，而β-HDL的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流，從而發(fā)揮其抗動脈粥樣硬化功能[2]。ApoM是S1P的主要載體，并調(diào)節(jié)S1P的代謝，維持機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[3]。ApoM與S1P結(jié)合具有抗炎作用[4]。加入外源性的ApoM-S1P抑制腫瘤壞死因子-α的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥作用[5]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能體內(nèi)外上調(diào)ApoM的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不清楚[6]。本研究將進(jìn)一步探討雌激素調(diào)節(jié)ApoM基因轉(zhuǎn)錄的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2肝癌細(xì)胞株和人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）購自美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、無酚紅DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、活性炭處理的胎牛血清和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Gibco公司；雌二醇和牛血清清蛋白結(jié)合雌激素（E2-BSA）購自美國 Sigma公司；雌激素受體α（ER-α）拮抗劑MPP購自英國Tocris公司。質(zhì)粒pGL3-basic和雙熒光報(bào)告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Gel Extraction Kit試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司的；LightShift?Chemiluminescent凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）試劑盒購自美國Pierce公司；染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）試劑盒購自美國Thermofisher公司?？俁NA提取試劑盒K352購自上海申能博彩科技有限公司。首鏈cDNA合成試劑盒購自立陶宛Ferments公司。引物及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。兔抗人ApoM多克隆抗體由瑞典隆德大學(xué)臨床化學(xué)系制備?？谷藛慰寺】贵w和辣根標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗購自美國Santa Cruz公司。ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。總蛋白提取試劑盒購自上海炎彬化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)按常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，用含10%活性炭處理的胎牛血清的無酚紅DMEM稀釋消化后離心的細(xì)胞，按5×104μL-1孔接種至6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次，再加入無酚紅DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，第3天PBS洗滌后，加入含不同濃度17β-雌二醇共價(jià)衍生物（E2-BSA）的無酚紅DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總RNA及蛋白待測。拮抗劑試驗(yàn)與濃度試驗(yàn)與之類似，區(qū)別為第3天洗滌后，加入雌二醇（10 μmol∕L）或 E2-BSA（100 nmol∕L）及 ER-α MPP（1 μmol∕L），繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，提取細(xì)胞總 RNA 待測。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和熒光定量PCR RT-PCR步驟按照Ferments公司試劑盒及其說明書進(jìn)行。熒光定量PCR在LightCycler熒光定量PCR儀上完成。本研究所需引物及探針見表1。反應(yīng)條件為95℃3min；95℃5s，60℃15s，共40個循環(huán)；40℃1min。

1.2.3 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測ApoM的表達(dá) 將蛋白與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液混勻，置100℃5 min進(jìn)行蛋白變性，冰上放置。取變性樣本10 μL上樣（總蛋白上樣量20 μg），電泳，以250 mA電流2 h轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。含3%BSA的加吐溫-20磷酸鹽緩沖溶液（PBST）緩沖液中室溫封閉1 h后，用ApoM多克隆抗體4℃孵育過夜，1×PBST洗膜3次后，加二抗室溫孵育2 h后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光檢測。

1.2.4 pCDNA3.1-ER-α表達(dá)載體的構(gòu)建 以人全序列基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)含Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)的引物。從MCF-7細(xì)胞中抽提總RNA，RT-PCR擴(kuò)增ER-α基因。PCR 條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min；16℃ 保存。1% 瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因。將ER-α回收產(chǎn)物和pCDNA3.1載體用限制性內(nèi)切酶Xho I與EcoRI進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收。將ER-α目的基因片段和pCDNA3.1載體進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，接種于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。挑取單克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)Xho I和EcoRI酶切進(jìn)行鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測序驗(yàn)證。

1.2.5 ApoM啟動子區(qū)（野生型和點(diǎn)突變型）熒光素酶表達(dá)載體（pGL3-ApoM）的構(gòu)建 （1）根據(jù)基因信息學(xué)設(shè)計(jì)預(yù)測了ApoM啟動子區(qū)可能存在不同ER-α結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物，分別添加了BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)（表2）。以全基因組為模板，PCR方法獲得不同長度ApoM啟動子片段。PCR條件：94℃5 min；94℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pGL3-basci載體中，陽性克隆經(jīng)酶切鑒定及DNA測序鑒定。（2）點(diǎn)突變載體的構(gòu)建，設(shè)計(jì)欲定點(diǎn)突變的引物。正義引物：5′-TTAATAAACTCTAATATACTCACTGCCCAAATTTTGT TTGTTTTT-3′，反義引物：5′-AAAAACAAACAAAACAG TGAGTATATTAGAGTTTATTAA-3′。以構(gòu)建好的ApoM P3質(zhì)粒做模板，PCR擴(kuò)增目的基因。PCR條件：94℃5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 7 min，18 個循環(huán)；72℃10 min；16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶酶切后連接入pGL3-basci載體中，陽性克隆經(jīng)酶切鑒定及DNA測序鑒定。將測序正確的重組質(zhì)粒分別命名為P1、P2、P3和 P4。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測 （1）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將 MCF-7按 2×104μL-1接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。對照組pGL-3-BASIC、pcDNA3.0和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組為不同啟動子區(qū)長度的pGL-3-ApoM、pcDNA3.0-ER-α和pRL-SV40共轉(zhuǎn)染。（2）熒光素酶活性測定：轉(zhuǎn)染48 h后，加入裂解液裂解細(xì)胞，收集上清液，并用于熒光素酶活性測定，按照試劑說明書進(jìn)行操作。熒光素酶相對活性用熒光素酶活性∕海腎熒光素酶活性的比值（Luc∕RL）表示；每組同時轉(zhuǎn)染3孔，進(jìn)行3次獨(dú)立檢測，計(jì)算Luc∕RL 的平均值。

1.2.7 EMSA 利用上述構(gòu)建ApoM啟動子區(qū)P3位點(diǎn)報(bào)告基因及點(diǎn)突變基因?yàn)樘结樂治鯡R-α與ApoM啟動子的結(jié)合活性。依照美國Pierce公司試劑盒操作說明進(jìn)行，等量細(xì)胞核提取物（5 μg）與生物標(biāo)記的凝膠寡核苷酸探針或冷探針在20℃以下孵育30 min，反應(yīng)混合物經(jīng)6.5%聚丙烯酰胺凝膠在預(yù)冷0.5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液中4℃、100 V電泳1 h。用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用封閉液室溫封閉膜15 min；加放辣根過氧化物酶耦聯(lián)的鏈親和素，室溫孵育15 min，加放化學(xué)發(fā)光底物室溫孵育2 min，暗室中X射線膠片曝光。

1.2.8 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（CHIP-PCR） 按照Piece Agarose CHIP Kit試劑盒說明進(jìn)行操作。選取MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h，加入終濃度1%的甲醛，37℃交聯(lián)固定DNA與蛋白質(zhì)10 min。收集細(xì)胞用裂解緩沖液重懸，冰上放置15 min，每5分鐘渦旋混勻1次。離心取上清液，將獲得的5 μL上清液作為Input組存于-80℃?zhèn)溆?。另?5 μL加入ER-α抗體，4℃孵育過夜處理，離心收集沉淀。與Input組同時用5 mmol∕L氯化鈉65℃解交聯(lián)4 h，DNA純化后溶于30 μL洗脫液中。針對ApoM上游啟動子區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增包含ER-α識別序列片段，以確定ER-α與ApoM的結(jié)合；正義引物：5′-TTGGGCAACAGAACGAGACT-3′，反義引物：5′-TATCCCATGGACTGCCACAA-3′

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的E2-BSA作用于HepG2細(xì)胞后ApoM mRNA和蛋白水平變化 不同濃度的E2-BSA作用于HepG2細(xì)胞24 h后，ApoM組的mRNA和蛋白水平與0 mol∕L E2-BSA比較呈濃度依賴性升高，其中100 nmol∕L的E2-BSA顯著上調(diào)了ApoM的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 MPP抑制試驗(yàn) MPP抑制了E2和E2-BSA對HepG2細(xì)胞中ApoM的上調(diào)作用。見圖2。

2.3 ER-α基因載體構(gòu)建及其重組質(zhì)粒鑒定 從MCF-7細(xì)胞提取總RNA，以其逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增ER-α。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，大約在2 000 bp的位置可見特異性目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖3 A。將PCR目的片段回收后，將pcDNA3.1空載體雙酶切，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定和Xho I與Eco-RI雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，在2 000 bp位置可見特異性目的條帶。經(jīng)測序比對，結(jié)果一致，說明ER-α基因已成功克隆至pCDNA3.1-載體上。見圖3 B。

2.4 ApoM熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及其重組質(zhì)粒鑒定 PCR擴(kuò)增ApoM啟動子非編碼區(qū)基因片段產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，其基因片段大小與預(yù)計(jì)相符，分別為 3 060 bp，2 207 bp、1 740 bp、1 189 bp（P1、P2、P3、P4）左右的清晰條帶，表明已經(jīng)獲得ApoM啟動子非編碼基因片段。見圖4 A、B。將PCR目的片段回收后，將pGL3-Basic空載體雙酶切，經(jīng)連接和轉(zhuǎn)化后挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定和經(jīng)內(nèi)切酶BglⅡ與Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切。結(jié)果顯示，在 3 060、2 207、1 740、1 189 bp（ApoM P1、P2、P3、P4）上相應(yīng)的位置可見特異性目的條帶。經(jīng)測序比對，結(jié)果一致，說明ER-α基因已成功克隆至pGL3-Basic-載體上。見圖4 C。

圖1 E2-BSA作用于HepG2細(xì)胞對ApoM mRNA和蛋白的影響

圖2 不同雌激素和MPP作用于HepG2細(xì)胞對ApoM mRNA的影響

圖3 ER-α基因載體構(gòu)建及重組ER-α質(zhì)粒的鑒定

圖4 重組ApoM質(zhì)粒的構(gòu)建

2.5 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測ER-α對ApoM啟動子活性的影響 ER-α和不同ApoM啟動子片段共轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞的熒光素酶實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，ApoM啟動子P3位置[-1 580～ -1 575 bp（-GGTCA）]比 P1、P2和 P4有更高的熒光素活性，而突變的P3熒光素酶活性則顯著下降。這一結(jié)果說明ApoM啟動子P3位置[-1 580～-1 575 bp（-GGTCA）]存在著 ER-α 結(jié)合位點(diǎn)。見圖5。

2.6 EMSA驗(yàn)證ER-α與ApoM啟動子序列的結(jié)合活性 只加入核蛋白作為陰性對照（圖6，泳道1）。EMSA結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的探針可與核蛋白結(jié)合（圖6，泳道2），而在冷競爭中復(fù)合物消失（圖6，泳道3），在突變競爭中，可觀察到核蛋白與DNA形成的復(fù)合物（圖6，泳道4），加入抗ER-α抗體后，復(fù)合物的條帶減弱，且在泳道后出現(xiàn)另一條復(fù)合物帶（圖6，泳道5）。以上結(jié)果提示ER-α與ApoM存在著相互作用。

2.7 CHIP-PCR驗(yàn)證ER-α與ApoM的啟動子區(qū)結(jié)合采用CHIP-PCR驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)ApoM啟動子區(qū)存在著ER-α的結(jié)合位點(diǎn)。將抗ER-α抗體與裂解后的核蛋白結(jié)合，用RT-PCR對ApoM啟動子P3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增?？笶R-α抗體組ApoM的表達(dá)水平是陰性對照組（IgG）的12倍，這提示內(nèi)源性 ER-α直接與 ApoM啟動子（-1 676、-1 519 bp）結(jié)合。見圖7。

圖5 雙熒光酶報(bào)告系統(tǒng)分析ER-α對ApoM啟動子活性的影響

圖6 EMSA驗(yàn)證ER-α與ApoM啟動子結(jié)合活性

圖7 CHIP-PCR驗(yàn)證ER-α與ApoM啟動子區(qū)結(jié)合

3 討 論

作者前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過ER能在體內(nèi)外上調(diào)ApoM的表達(dá)，但具體機(jī)制尚不清楚[6]。ER分為2大類，即經(jīng)典的ER-α、ER-β及以G蛋白耦聯(lián)雌激素受體為代表的膜雌激素受體。本研究結(jié)果顯示，E2-BSA（不能通過細(xì)胞膜）能以劑量依賴性上調(diào)ApoM的表達(dá)，說明雌激素可以通過膜表面的ER來調(diào)節(jié)ApoM的表達(dá)，這與以前的觀點(diǎn)相反。以前的觀點(diǎn)認(rèn)為膜表面的ER只是介導(dǎo)雌激素快速的非基因效應(yīng)[7]。也有研究報(bào)道膜表面ER參與了基因的轉(zhuǎn)錄。定點(diǎn)突變了所有膜表面ER受體，但其他ER并不受影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素未能調(diào)節(jié)所有組織中相應(yīng)基因的表達(dá)[8]。作者通過應(yīng)用MPP分別與雌激素和E2-BSA共同作用于HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPP能抑制激素上調(diào)HepG2細(xì)胞ApoM mRNA效應(yīng)。這意味著ER-α介導(dǎo)了雌激素對ApoM轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。ApoM是前β-高密度脂蛋白膽固醇（β-HDL）顆粒形成及成熟的必要條件[2]，ApoM還可以與S1P結(jié)合，通過S1P受體維持內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[4-5，9]，因此，從ApoM方面也可以解釋雌激素抗動脈粥樣硬化的作用為了進(jìn)一步探討ER-α調(diào)節(jié)ApoM的分子機(jī)制，作者采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和點(diǎn)突變技術(shù)對ApoM啟動子區(qū)可能的ER-α結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ApoM 啟動子區(qū)（-GGTCA-，-1 580～-1 575 bp）是 ApoM轉(zhuǎn)錄活化的基本要素，且將該區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)突變則消除了這一轉(zhuǎn)錄活性。經(jīng)典的雌激素反應(yīng)元件（GGTCA nnn TGACC，n代表任意堿基）是一回文結(jié)構(gòu)元件，這是由13個反向重復(fù)的堿基對，和在重復(fù)序列中的3個任意替換的堿基。本研究中發(fā)現(xiàn)，ApoM啟動子GGTCA（-1 580～-1 575 bp）是經(jīng)典的雌激素反應(yīng)元件的半個部分。多項(xiàng)研究表明，雌激素是通過非完整或一半雌激素反應(yīng)元件來調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，這些反應(yīng)元件緊挨或遠(yuǎn)離一半回文結(jié)構(gòu)[10-12]。作者應(yīng)用EMSA和CHIPPCR進(jìn)一步驗(yàn)證ER-α通過蛋白-DNA交聯(lián)的方式與ApoM結(jié)合。其他核因子受體也通過與ApoM啟動子區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)ApoM的表達(dá)[13-14]。VENTECLEF等[14]應(yīng)用DNA親和沉淀及染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)在ApoM啟動子區(qū)（-33～-21 bp）存在肝核因子-4的結(jié)合位點(diǎn)。已有多項(xiàng)研究報(bào)道，ER-α與LDL和HDL紊亂緊密聯(lián)系，從而ER-α在脂代謝中的重要作用[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，雌激素通過ER-α與ApoM啟動子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而上調(diào)ApoM的表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究雌激素與ApoM的抗動脈粥樣硬化奠定了基礎(chǔ)。