羅 艷，李清香，曹云濤（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院新生兒科，貴州遵義563003）

新生兒急性肺損傷（ALI）是新生兒的常見疾病之一，主要由肺內(nèi)外因素引起肺泡炎癥水腫和毛細血管膜損傷，從而導致肺泡通氣血流比例失調(diào)，其主要臨床表現(xiàn)是缺氧、進行性呼吸困難和呼吸衰竭[1-2]。ALI的進一步加重可發(fā)展為新生兒急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越多的早產(chǎn)兒被送入重癥監(jiān)護室救治。因此，ALI∕ARDS的發(fā)病率和死亡率都不斷提高，成為學者們的研究熱點之一。

新生兒特別是早產(chǎn)兒，因其免疫力低下，極易被細菌感染，各類細菌均可接觸氣道導致局部炎癥反應(yīng)失調(diào)[3-4]。據(jù)統(tǒng)計，氣道感染中以革蘭陰性桿菌感染為主[5]。有學者報道，革蘭陰性細菌死亡或活躍繁殖時所釋放的內(nèi)毒素（LPS）（其化學本質(zhì)為脂多糖）可通過募集大量中性粒細胞到氣道局部而引起ALI∕ARDS[6]。然而ALI∕ARDS在人活體肺中的發(fā)生、發(fā)展過程大部分來自于尸體解剖，在一定程度上限制了人們對ALI∕ARDS肺部病理變化的認識[7]。因此，動物模型對ALI∕ARDS發(fā)病機制、有效治療藥物研究具有重要意義。

目前，已報道的LPS誘導ALI∕ARDS動物模型主要針對成人ALI∕ARDS，LPS的給藥途徑主要有氣管給藥、腹腔給藥、尾靜脈給藥。而ALI∕ARDS新生鼠ALI∕ARDS動物模型LPS的給藥途徑主要是腹腔給藥。鑒于臨床引起新生兒肺部感染性損傷的細菌傳播方式可能為空氣或血源性傳播，是制備最理性的ALI∕ARDS動物模型。本文通過比較LPS鼻腔滴藥、氣管給藥、腹腔給藥3種不同給藥途徑所制備動物模型的區(qū)別，為更好地研究ALI∕ARDS發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠，成年雌性6只，雄性3只，均購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于獨立、清潔的通氣飼養(yǎng)盒內(nèi)，飼料、水均經(jīng)嚴格消毒，所有操作于超凈臺內(nèi)完成。實驗過程中，動物的使用嚴格遵循遵義醫(yī)學院動物倫理委員會要求。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 將新生2～3 d SD大鼠分為3組：（1）鼻腔滴藥組（對照組和LPS組），LPS組采用左手大拇指和食指固定新生鼠頭，鼻腔中滴入不同劑量LPS（3、4、5、6、8 mg∕kg），然后分別于 1、6、12、24、72 h 處死新生鼠（n≥5）；對照組鼻腔滴入等量生理鹽水，同樣于1、6、12、24、72 h 處死新生鼠（n≥5）。（2）氣管給藥組（對照組和LPS組）：將新生鼠取仰臥位固定于操作臺上，正中切開頸前皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管。用小兒靜脈留置針植入暴露的氣管后，拔出針芯，LPS組給予氣管內(nèi)滴入LPS（LPS量、處死時間同鼻腔滴藥組）（n≥5）；其對照組給予氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。（3）腹腔給藥組（對照組和LPS組）：LPS組給予腹腔注入LPS（LPS量、處死時間同鼻腔滴藥組）（n≥5）；其對照組給予氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。觀察不同組新生鼠給予LPS后的食欲、活動情況及死亡率。依據(jù)第一步實驗結(jié)果，將 LPS 劑量選定為 3、4、5 mg∕kg。

1.2.2 組織學檢查 各組于各時間點用10%水合氯醛麻醉新生SD大鼠，打開胸前后，首先肉眼觀察肺組織的大體病理改變，然后取右肺常規(guī)固定、包埋、脫水、切片后蘇木精-伊紅（HE）染色。肺部病理評分主要依據(jù)參考文獻[8]對肺組織細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺泡周圍炎癥進行病理評分。

1.2.3 肺組織濕重∕干重（W∕D）比值的測定 處死新生鼠后快速打開胸腔游離雙肺（n=8），首先用無菌紗布蘸干雙肺表面的血水，取左肺稱其濕重（W），然后將其放入57℃烤箱內(nèi)將濕肺烘干（烘烤時間為24 h），再稱其干重（D）；最后計算左肺的W∕D值。以此來反映肺水腫程度。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗 大鼠取仰臥位麻醉，處死新生鼠（n=8），并暴露氣管后用小兒靜脈留置針進行氣管插管，用冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)灌洗3次，每次0.3 mL，最終收集PBS共0.5 mL，灌洗液細胞計數(shù)后離心，取上清液-80℃保存，對細胞因子水平進行檢測，細胞沉渣瑞氏染色進行分類計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Graphpad Prism5.03統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗；多樣本間比較采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間點、不同劑量、不同途徑給藥后新生鼠的死亡率 給予新生兒鼠LPS后，出現(xiàn)吃奶反應(yīng)差及活動量明顯減少，劑量越大癥狀越明顯，死亡率越高。當LPS劑量小于5 mg∕dL時新生鼠死亡率可降低至25%以下。見表1。

2.2 不同時間點不同給藥途徑肺組織的病理改變 當LPS劑量為3 mg∕dL時，鼻腔滴藥組、氣管給藥組、腹腔給藥組各個時間點的炎癥病理評分在支氣管細支氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當 LPS 劑量為 4 mg∕dL 或 5 mg∕dL，滴入LPS后1、24、72 h，支氣管細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但時間點為 6、12 h各組病理評分均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1～6。

表1 不同時間點、不同劑量、不同途徑給藥后新生鼠的死亡率比較（n=8）

2.3 不同時間點不同給藥途徑肺組織水腫參數(shù)檢測 LPS經(jīng)鼻腔途徑或腹腔注射途徑進入新生鼠肺部6～12 h后，發(fā)現(xiàn)劑量為 3 mg∕kg 或 4 mg∕kg時，肺部水腫明顯且肺臟無明顯出血點，當劑量增加至5 mg∕kg時，肺部除水腫外，還可見大量出血點及胸腔積液。當LPS（3 mg∕kg或 4 mg∕kg）經(jīng)氣管途徑進入肺部 6～12 h，可見肺部水腫明顯且肺臟有少許出血點。

三組各個時間點的W∕D值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中時間點為 6、12 h 時 W∕D值均達高峰，時間點為24、72 h時W∕D值均呈下降趨勢。見表2。

圖1 鼻腔滴藥組不同劑量LPS、不同時間點肺組織的病理情況（HE，200×）

圖2 鼻腔滴藥組不同劑量LPS、不同時間點細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

圖3 氣管給藥組不同劑量LPS、不同時間點肺組織的病理情況（HE，200×）

圖4 氣管給藥組不同劑量LPS、不同時間點細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

圖5 腹腔給藥組不同劑量LPS、不同時間點肺組織的病理情況（HE200×）

圖6 腹腔給藥組不同劑量LPS、不同時間點細支氣管周圍炎癥、血管周圍炎癥、肺間質(zhì)炎癥病理評分

表2 不同時間點、不同劑量、不同途徑給藥后各組新生鼠左肺W∕D比值比較（n=5，±s）

表2 不同時間點、不同劑量、不同途徑給藥后各組新生鼠左肺W∕D比值比較（n=5，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05

時間 鼻腔滴藥組腹腔給藥組0 h 1 h 6 h 12 h 24 h 72 h 3 mg∕kg 4.67±0.11 4.95±0.40 5.96±0.14a 6.20±0.38a 5.08±0.43 4.71±0.16 4 mg∕kg 4.73±0.12 5.03±0.21 6.08±0.18a 6.15±0.14a 4.95±0.27 5.08±0.18 5 mg∕kg 4.76±0.16 5.35±0.34 5.69±0.19a 6.04±0.00a 4.55±0.09 4.69±0.15氣管給藥組3 mg∕kg 4.71±0.15 4.79±0.10 5.80±0.26a 5.61±0.18a 4.68±0.19 4.16±0.16 4 mg∕kg 4.60±0.08 4.71±0.16 5.70±0.19a 5.72±0.14a 4.62±0.07 4.67±0.09 3 mg∕kg 4.66±0.06 4.858±0.08 5.66±0.16a 5.918±0.22a 4.692±0.14 4.54±0.09 4 mg∕kg 4.50±0.10 4.74±0.05 5.58±0.36a 6.642±0.13a 4.55±0.20 4.51±0.13 5 mg∕kg 4.77±0.35 4.78±0.16 5.92±0.24a 6.35±0.14a 4.62±0.16 4.59±0.12

表3 BALF中不同劑量LPS、不同時間點PMN總數(shù)比較（±s，%）

表3 BALF中不同劑量LPS、不同時間點PMN總數(shù)比較（±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與鼻腔滴藥組比較，bP＜0.05

時間0 h 1 h 6 h 12 h 24 h 72 h鼻腔滴藥組腹腔給藥組3 mg∕kg 2.57±0.53 4.35±0.65 9.53±0.51a 12.4±0.52a 9.32±0.47a 4.42±0.65 4 mg∕kg 3.87±0.770 4.37±70.45 10.88±1.51a 12.46±0.85a 7.55±1.19a 4.51±0.52 5 mg∕kg 3.05±0.92 4.02±0.52 10.11±1.64a 11.97±0.78a 5.87±0.94a 5.16±0.94氣管給藥組3 mg∕kg 6.498±0.34a 7.65±0.62 14.59±1.34a 16.43±1.69a 11.22±1.54a 10.39±1.68 4 mg∕kg 7.43±0.54ab 8.69±0.45 13.34±1.19a 16.69±1.67a 10.99±2.22 7.90±1.833 mg∕kg 4.90±0.79 7.59±1.09 12.13±1.17a 10.14±0.81a 7.15±0.33a 5.06±0.62 4 mg∕kg 3.68±0.56 6.24±1.09 10.84±1.08a 8.78±1.03a 7.10±0.97a 5.10±1.10 5 mg∕kg 3.90±0.78 5.95±1.04 11.95±1.92a 7.58±1.30a 7.15±0.81a 5.75±0.89

2.4 肺泡灌洗液（BALF）中多形核白細胞（PMN）計數(shù) 三組時間點為6、12 h時，BALF中PMN值均顯著高于對照組，24 h時PMN仍高于對照組，但較12 h時BALF中PMN值降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但1、72 h時BALF中PMN值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同給藥途徑的對照組中PMN比較，氣管滴入組中PMN值顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

3 討 論

ALI是一種常見于重癥監(jiān)護室里的危重疾病。據(jù)統(tǒng)計，該病的死亡率約為 50%～60%[9]。然而，ALI∕ARDS 的發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今仍不清楚。目前，機械通氣是治療ALI∕ARDS的基礎(chǔ)方式，但由此導致的呼吸機相關(guān)性肺炎是增加患兒死亡的原因之一，其病原菌以革蘭陰性桿菌為主[3]。有研究表明，革蘭陰性菌（如肺炎克雷伯、大腸埃希菌）是新生兒肺部感染的主要致病菌[5]。目前，針對ALI∕ARDS發(fā)病機制的研究資料主要來源于動物模型，其中報道的ALI∕ARDS動物模型中成年鼠與新生鼠的給藥途徑不同。眾所周知，抗原進入機體因其途徑、劑量或頻次的不同可使機體產(chǎn)生不同強度的免疫應(yīng)答，且過高、過低的抗原劑量可誘導免疫耐受，只有適中的劑量方可誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

本研究比較了LPS劑量3～8 mg∕kg不同給藥途徑新生鼠的死亡率，經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，當給藥途徑為鼻腔滴藥和腹腔給藥時LPS劑量為3～5 mg∕kg時，新生鼠的死亡率可控制在25%以下；但給藥途徑為氣管給藥時，如果將死亡率控制在25%以下，LPS劑量范圍應(yīng)為3～4 mg∕kg。因此，本研究選擇了 LPS 劑量為 3、4、5 mg∕kg，給藥途徑為鼻腔滴藥、腹腔給藥建立肺損傷模型；而氣管給藥途徑的肺損傷模型的LPS劑量為3、4 mg∕kg，進而對比選擇最佳肺損傷模型。

本研究結(jié)果顯示，LPS經(jīng)鼻腔途徑或腹腔注射途徑進入新生鼠肺部時，肺部炎癥結(jié)果相似，均隨著LPS劑量的增加而加重。LPS（3 mg∕kg 或 4 mg∕kg）進入體內(nèi) 6～12 h，肺部體積增大、炎癥明顯，且肺臟無明顯出血點，24 h后炎癥呈減輕趨勢。當劑量增加至5 mg∕kg時，肺部除體積增大及炎癥細胞浸潤外，還可見大量出血點及胸腔積液，提示該劑量可導致肺出血，從而并不適合制備該模型。這與施展等[10]的研究結(jié)果相似。當LPS經(jīng)氣管途徑注入新生鼠體內(nèi)時，肺部體積、炎癥程度也隨劑量的增加而加重，且肺臟表面可見少許出血點，24 h后炎癥較LPS注入前減輕。肺W∕D值可反映新生鼠予LPS后肺部水腫情況，該實驗發(fā)現(xiàn)LPS組在6～12 h W∕D值增加，但24 h后W∕D值與對照組比較無顯著差異，提示新生鼠給予LPS 24 h內(nèi)可能引起肺部血管通透性增加，導致肺損傷。

導致ALI最常見的因素是革蘭陰性菌敗血癥。SOOD等[11]將大腸埃希菌內(nèi)毒素注入新生豬體內(nèi)成功誘導肺部中性粒細胞聚集，產(chǎn)生肺損傷。本研究結(jié)果顯示，氣管給藥模型新生鼠肺部有大量PMN浸潤，鼻腔滴藥次之，腹腔給藥時，模型組肺內(nèi)PMN數(shù)量明顯較前二者少。這與李紅霞等[12]的研究結(jié)果相似。但值得注意的是，本實驗發(fā)現(xiàn)氣管給藥途徑的對照組中PMN值較另外兩組中的對照組中PMN值得顯著增高，這可能與氣管給藥途徑需切開頸前皮膚暴露氣管后將藥經(jīng)注射器注入肺內(nèi)，屬于有創(chuàng)操作相關(guān)。

綜上所述，以上3種途徑均可成功誘導新生大鼠ALI∕ARDS動物模型。但氣管給藥途徑屬于有創(chuàng)操作，該操作本身可能導致PMN在肺部聚集，從而影響結(jié)果的準確性。而腹腔注射雖可誘導肺部損傷，但腹腔注射LPS也可成功誘導膿毒血癥導致腎損傷，這使建立的模型可能同時存在肺、腎等臟器損傷，而影響實驗結(jié)果[13]。鼻腔滴藥可以成功制備肺損傷模型，且其感染途徑接近臨床新生兒呼吸道感染途徑類型，故根據(jù)本實驗結(jié)果推薦該途徑為首選制備ALI∕ARDS動物模型。