郝彩琴，冷曉紅，郭鴻雁，陳海燕（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川750002）

柴胡來源于傘形科柴胡屬植物，為常用中藥，在我國已有2 000多年的應(yīng)用歷史，《中華人民共和國藥典》2015版收載的柴胡品種為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根[1]。

柴胡味辛、苦，性微寒，具有疏散退熱、舒肝升陽之功效，主治感冒發(fā)熱、寒熱往來、瘧疾、月經(jīng)不調(diào)及子宮脫垂等癥狀?，F(xiàn)代藥理研究證明，柴胡具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、保肝利膽、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用[2-3]。柴胡的藥效化學(xué)成分主要為皂苷、黃酮類、揮發(fā)油、植物甾醇和多糖等[4-5]，其中柴胡黃酮具有較強(qiáng)的抗流感病毒作用，而且具有較好的抗炎、降溫效果和對多種細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制或殺滅作用[6-8]。有研究報(bào)道，柴胡的地上部位莖、葉、果實(shí)和地下部分根都含有黃酮類，而且不同部位黃酮的含量不同，且地上部位黃酮的含量要遠(yuǎn)高于地下部位[9-10]。

柴胡由于產(chǎn)地局限，蘊(yùn)藏量稀少，長期盲目采挖已使野生資源瀕危，被寧夏列為植物資源修復(fù)的重點(diǎn)品種，在寧夏柴胡屬于六盤山區(qū)特色藥材，現(xiàn)已形成規(guī)?；N植，但柴胡是以根入藥為主的傳統(tǒng)中藥，莖葉多棄之不用，造成資源利用不足，為了開發(fā)利用藥源，本研究對寧夏栽培柴胡地上部分黃酮類化合物的提取方法和溶劑進(jìn)行系統(tǒng)研究，為充分利用和擴(kuò)大柴胡藥用部位提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），比色皿（玻璃），TYS-400A型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司），EL204萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SIB-Ⅲ型循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），78-1型磁力加熱攪拌器（江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司），數(shù)控KQ-600DE型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），SHY-2A水浴恒溫振蕩器（常州國宇制造有限公司），美的EG720FF1-NS微波爐（Midea公司），KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.1.2 藥品與試劑 蘆?。ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號(hào)：100080-201409），亞硝酸鈉（上海廣諾化學(xué)儀器有限公司），硝酸鋁（上海廣諾化學(xué)儀器有限公司），氫氧化鈉（煙臺(tái)市雙雙化工有限公司）；無水乙醇（分析純，西安化學(xué)試劑廠）、食用乙醇、蒸餾水。

1.1.3 藥材 柴胡地上部分（2016年9月采自固原隆德縣柴胡種植基地，經(jīng)鑒定為北柴胡地上部分），自然晾干，粉碎過藥典二號(hào)篩。

1.2 方法

1.2.1 紫外線檢測方法的建立

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照文獻(xiàn)[11]中的方法并稍作改進(jìn)，取10.6 mg蘆丁用30%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.106 mg∕mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取 0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液置于7個(gè)25 mL的容量瓶中，用30%的乙醇溶液稀釋至10 mL；加入濃度為5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，靜置6 min，再加入濃度為10%的硝酸鋁溶液1 mL，靜置6 min，然后再加入4%的氫氧化鈉溶液1 mL，最后用30%的乙醇溶液定容，靜置10 min，以試劑空白作為參比，用1 cm比色皿在400～800 nm波長范圍進(jìn)行掃描，測得最大吸收峰位于510 nm處，然后在510 nm波長處測定吸光度。得到以下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

式中：A為吸光度，C為質(zhì)量濃度（mg∕mL）；R2為0.999 6。蘆丁乙醇溶液在 0.000 0～0.042 4 mg∕mL 的范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好。

黃酮濃度的計(jì)算公式為：

式（1）中：A為吸光度，C表示黃酮的質(zhì)量濃度（mg∕mL）。

式（2）中：C為黃酮的質(zhì)量濃度（mg∕mL），M柴胡為柴胡地上部分的質(zhì)量（mg），V總為粗提液的定容體積，V取為移取用于測定黃酮濃度的粗提液的體積。

1.2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL 5份，分別置于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定。

1.2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL 3份，分別置于25 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定，第1次測定為0 min，以后每隔10 min測定1次，共測定60 min。

1.2.1.4 重復(fù)性測定 準(zhǔn)確稱取柴胡地上部分粗粉1.000 g，按靜態(tài)回流法用55%乙醇進(jìn)行提取，提取液過濾濃縮，并定容于25 mL容量瓶中，平行做5份重復(fù)，各取1 mL定容后的溶液。

1.2.1.5 加樣回收率測定 準(zhǔn)確稱取柴胡地上部分粗粉0.500 g，共6份，按靜態(tài)回流法用55%乙醇進(jìn)行提取，提取液過濾、濃縮，并定容于25 mL容量瓶中，然后各取1 mL分別加入25 mL容量瓶中，并各加入0.21 mg∕mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.6 mL，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定項(xiàng)下要求加入其他顯色試劑，在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定條件下進(jìn)行吸光度測定，并按下式計(jì)算加標(biāo)回收率：加標(biāo)回收率=（加標(biāo)樣試測定值-試樣測定值）∕加標(biāo)量×100%。

1.2.1.6 樣品測定 精密移取稀釋定容好的提取液各1 mL，并分別置于25 mL容量瓶中，根據(jù)“1.2.1.1”項(xiàng)下紫外線檢測方法進(jìn)行含量測定，為防止提取液顏色對測定結(jié)果的影響，參照文獻(xiàn)[12]以不加硝酸鈉等顯色劑的試樣（即精密移取稀釋定容好的提取液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%的乙醇至刻度，搖勻）作為參比。

1.2.2 提取溶劑的選擇

1.2.2.1 溶劑提取過程 精確稱取寧夏栽培柴胡地上部分粗粉1.00 g共18份，分別置入100 mL具塞三角瓶中，并編號(hào)，1～3號(hào)分別加入35%乙醇溶液25 mL，4～6號(hào)分別加入45%乙醇溶液，25 mL，7～9號(hào)分別加入55%乙醇溶液25 mL，10～12號(hào)分別加入65%乙醇溶液25 mL，13～15號(hào)分別加入75%乙醇溶液25 mL，16～18號(hào)分別加入85%乙醇溶液25 mL，分別在室溫下浸泡24 h，并減壓、抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干，稱重，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用30%乙醇定容至刻度，搖勻。按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

1.2.2.2 不同溶劑提取所得浸膏和總黃酮的得率 根據(jù)浸膏得率和測定的黃酮提取率，應(yīng)用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 提取方法的選擇

1.2.3.1 提取過程

1.2.3.1.1 恒溫水浴振蕩器提取過程 精確稱取柴胡地上部分粗粉1.000 g，置入100 mL具塞三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)55%乙醇溶液25.0 mL，室溫浸泡20 min，在恒溫水浴振蕩器上，室溫振蕩浸漬16 h，減壓抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，平行做4個(gè)樣，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

表1 不同溶劑提取所得浸膏和總黃酮的得率（n=3，±s，%）

表1 不同溶劑提取所得浸膏和總黃酮的得率（n=3，±s，%）

項(xiàng)目浸膏得率總黃酮提取率35%乙醇13.090±0.441 0.793±0.070 45%乙醇13.920±0.598 0.945±0.007 55%乙醇13.600±0.583 1.120±0.043 65%乙醇13.380±0.760 1.080±0.037 75%乙醇11.740±0.680 0.819±0.097 85%乙醇7.520±0.025 0.702±0.036

表2 不同方法提取的浸膏得率及總黃酮提取率（n=4±s，%）

表2 不同方法提取的浸膏得率及總黃酮提取率（n=4±s，%）

項(xiàng)目浸膏得率總黃酮提取率恒溫水浴振蕩器提取11.960±1.630 1.230±0.093靜態(tài)熱回流提取16.160±1.650 2.220±0.081動(dòng)態(tài)熱回流提取16.180±1.840 2.050±0.038超聲波輔助提取12.360±1.380 1.400±0.053微波輔助提取14.840±0.671 1.93±0.056

1.2.3.1.2 靜態(tài)熱回流提取過程 精確稱取柴胡地上部分粗粉1.000 g，置入250 mL平底燒瓶，加入體積分?jǐn)?shù)55%乙醇溶液25.0 mL，室溫浸泡20 min，在普通加熱回流裝置上，電熱套加熱回流40 min，冷卻，減壓抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃以下減壓蒸干，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，平行做4個(gè)樣，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

1.2.3.1.3 動(dòng)態(tài)熱回流提取過程 精確稱取柴胡地上部分粗粉1.000 g，置入250 mL平底燒瓶，加入體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇25.0 mL，室溫浸泡20 min，然后在磁力攪拌器上攪拌加熱回流提取40 min，冷卻，減壓抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，平行做4個(gè)樣，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

1.2.3.1.4 超聲波輔助提取法提取過程 精確稱取柴胡地上部分1.000 g，置入100 mL帶塞三角瓶中，加體積分?jǐn)?shù)入55%的乙醇25.0 mL，室溫浸泡20 min，在超聲波清洗儀上室溫超聲40 min，減壓抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃以下減壓蒸干，干浸膏用30%乙醇超聲溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，平行做4個(gè)樣，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

1.2.3.1.5 微波輔助提取法提取過程 精確稱取寧夏六盤山栽培柴胡地上部粗粉1.000 g，置入250 mL具塞三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)55%的乙醇25.0 mL，室溫浸泡55 min（保證樣品浸在溶劑中的總時(shí)間與其他方法一致），然后再用微波中火提取5 min（提取過程每隔1～2 min停 30 s），冷卻，減壓抽濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃以下減壓蒸干，干浸膏用30%乙醇超聲溶解轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，平行做4個(gè)樣，按照“1.2.1.6”項(xiàng)下樣品測定方法進(jìn)行含量測定。

1.2.3.2 不同方法提取的浸膏得率及總黃酮提取率 根據(jù)浸膏得率和測定的黃酮提取率，應(yīng)用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 精密度試驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下操作方法進(jìn)行測定，得平均A為0.250 2，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.866 5%，說明該方法的精密度良好。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下操作方法進(jìn)行測定，得平均A為0.247 8，RSD為0.346 7%，說明樣品在0～60 min內(nèi)測定是穩(wěn)定的。

2.3 重復(fù)性測定 按標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下操作方法進(jìn)行測定，得平均A為0.443 2，RSD為1.026%，說明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4 加樣回收率測定 平均回收率為99.27%，RSD為1.570%。

2.5 不同溶劑提取所得浸膏和總黃酮的得率 本試驗(yàn)所選6種溶劑對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的提取率有一定差異，其中55%乙醇提取的總黃酮提取率最高，為（1.120±0.043）%，相應(yīng)的浸膏得率也較高，為（13.600±0.583）%，因此，在選取方法時(shí)，采用55%乙醇為溶劑進(jìn)行提取。見表1。

2.6 提取方法的選擇 本試驗(yàn)所選5種方法對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的提取率有一定差異，其中靜態(tài)熱回流提取法的總黃酮提取率最高，為（2.220±0.081）%，相應(yīng)的浸膏得率也較高，為（16.160±1.650）%。見表2。

3 討 論

本試驗(yàn)通過紫外線檢測研究不同濃度乙醇即35%、45%、55%、65%、75%、85%乙醇為提取溶劑對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，55%乙醇對其提取率最高，其次是65%乙醇提取，而其他濃度乙醇對其提取率相對較低，說明寧夏栽培柴胡地上部分的黃酮類化合物極性相對較大，且55%的乙醇對其細(xì)胞的穿透能力更強(qiáng)。本試驗(yàn)通過紫外檢測研究不同方法即恒溫水浴振蕩器提取、靜態(tài)熱回流提取法、動(dòng)態(tài)熱回流提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮的提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜態(tài)熱回流提取法對其提取率最高，其次是動(dòng)態(tài)熱回流提取法，而其他提取法對其提取率相對較低，說明寧夏栽培柴胡地上部分的黃酮類化合物在熱的溶劑中溶解性更強(qiáng)。本試驗(yàn)首次同時(shí)考慮提取溶劑和提取方法對寧夏栽培柴胡地上部分總黃酮提取率的影響，這樣使所確定出的提取溶劑和方法更準(zhǔn)確、合理。本試驗(yàn)過程中采用了提取之前先用提取溶劑對藥材進(jìn)行浸泡，以便于溶劑更好地穿透藥材細(xì)胞，充分溶出藥材的有效成分。