胡曉芳，余永莉，陳 濤，張彬渝，劉茂生，蘇麗莉（遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，廣東珠海519041）

桉葉油是從桉樹(shù)葉中提取的具有芳香味的揮發(fā)性油，具有抗菌、抗氧化、抗炎、促滲透、殺蟲(chóng)、驅(qū)蚊、止癢及防腐作用[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，桉葉油能舒張氣管和血管平滑肌、心肌，其作用機(jī)制可能是影響膜上離子通道的離子流[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桉葉油對(duì)維甲酸（RA）導(dǎo)致胎鼠神經(jīng)管缺陷有一定的拮抗作用，其機(jī)制可能與桉葉油拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白過(guò)度表達(dá)有關(guān)。本研究利用桉葉油制備含藥血清，聯(lián)合RA作用體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平，從體外實(shí)驗(yàn)探討桉葉油是否也具有拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇SPF級(jí)SD大鼠，體重180～220 g[購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)編號(hào)：0094460，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002]；飼養(yǎng)條件：室溫24～27℃，通風(fēng)，相對(duì)濕度68%～80%，每天光照12 h，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品及試劑 RA粉末原料藥（北京貝利萊斯生物化學(xué)有限公司，批號(hào)：110801），桉葉油[桉葉素99.5%，德信行（珠海）香精香料有限公司，批號(hào)：110626]；選用金龍魚(yú)花生油作為藥品溶劑。

1.2 方法

1.2.1 桉葉油含藥血清的制備 選擇體重250～300 g清潔級(jí)的雄性SD大鼠，將其隨機(jī)分為6組，每組3只，分別作為正常血清組（大鼠自由飲食）、溶劑血清對(duì)照組（每只大鼠早晨灌胃花生油3 mL，每天1次，連續(xù)灌胃 7 d）、桉葉油血清組（分別用桉葉油 300、1 000、1 500 mg∕kg 于早晨灌胃，每天 1 次，連續(xù)灌胃 7 d）。各組末次灌胃后2.5 h左右，用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，解剖胸腔，用一次性無(wú)菌注射器心臟采血，離心，收集血清。無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，置于56℃水浴30 min滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 在無(wú)菌條件下取24 h內(nèi)新生SD大鼠的海馬組織，輕微機(jī)械吹打組織，用200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾、收集單細(xì)胞懸液。加入適量DMEM∕F12 全培養(yǎng)液[內(nèi)含 2% 維生素 B27、20 μg∕L 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）和 20 μg∕L 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）]，放入37℃、5%CO2飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中換液培養(yǎng)7 d，傳代1次，收集第2代神經(jīng)干細(xì)胞，輕微吹打、吹散細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養(yǎng)板，每孔4 mL，分為BrdU標(biāo)記組和對(duì)照組。BrdU 標(biāo)記組加入 BrdU 10 μmol∕L，對(duì)照組加入 DMEM∕F12全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h收集各孔細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞后，采用免疫熒光法檢測(cè)BrdU、Nestin。鑒定BrdU組一抗為兔抗鼠BrdU抗體，鑒定Nestin組一抗為兔抗鼠Nestin抗體，兩組二抗均為羊抗兔異硫氰酸熒光素-免疫球蛋白G（FITC-IgG）。并設(shè)立一抗為磷酸鹽緩沖溶液（PBS）的陰性對(duì)照組。使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.3 桉葉油含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43表達(dá)的影響 收集第二代神經(jīng)球細(xì)胞，加入新的無(wú)血清DMEM∕F12全培養(yǎng)液，輕微吹打、吹散細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于培養(yǎng)板，分為5組，分別加入自由飲食SD大鼠血清、溶劑花生油灌胃血清、桉葉油 1 500、1 000、300 mg∕kg灌胃鼠血清，各組血清終濃度為5%。各組細(xì)胞放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平，并采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平。

1.2.4 桉葉油含藥血清聯(lián)合RA對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43表達(dá)的影響 收集第2代神經(jīng)球細(xì)胞，加入新的無(wú)血清DMEM∕F12全培養(yǎng)液，輕微吹打、吹散細(xì)胞球，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養(yǎng)板，分為6組，正常SD大鼠血清5%+RA（5 μmol∕L），溶劑花生油含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），桉葉油 1 500 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），1 000 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L）、300 mg∕kg 含藥血清 5%+RA（5 μmol∕L），RA（5μmol∕L）。各組細(xì)胞放入37℃、5%CO2飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平，并采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，各組均數(shù)比較采用方差分析。檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 收集新生SD大鼠海馬組織細(xì)胞在無(wú)血清的DMEM∕F12全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，肉眼可見(jiàn)培養(yǎng)瓶中有乳白色小塊狀或者顆粒狀懸浮物，鏡下觀察懸浮物為聚集的細(xì)胞塊，細(xì)胞輪廓清晰，有光澤，其周?chē)袘腋〉乃兰?xì)胞碎片，瓶底也有大量有光澤的單個(gè)細(xì)胞。換液后吹散懸浮小塊繼續(xù)培養(yǎng)，如此換液吹散培養(yǎng)到第7天，可見(jiàn)大量大小不等的神經(jīng)細(xì)胞球。收集第2代細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果顯示Nestin、Brdu表達(dá)呈陽(yáng)性（圖1），整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)細(xì)胞貼壁現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.2 桉葉油含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達(dá)的影響 用5%的血清作用細(xì)胞后，桉葉油含藥血清各組細(xì)胞的Cx43蛋白及基因表達(dá)水平較正常血清組的表達(dá)水平均高（P＜0.05），Pax3蛋白及基因表達(dá)水平較正常血清組的表達(dá)水平均低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表1。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定（200×）

圖2 桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平

表1 桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43基因表達(dá)水平相對(duì)正常血清組Pax3、Cx43基因表達(dá)改變情況

2.3 桉葉油含藥血清聯(lián)合維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達(dá)的影響 用5%的血清+RA作用細(xì)胞后，與單純RA組比較，血清各組Pax3蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；桉葉油含藥血清各組的Pax3蛋白及mRNA較正常血清組表達(dá)水平均有差異（P＜0.05）。

用5%的血清+RA作用細(xì)胞后，與單純RA組比較，血清各組Cx43蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低；但在5%的血清+RA各組中，桉葉油各組Cx43蛋白及其mRNA與正常血清組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)合單純桉葉油血清可上調(diào)細(xì)胞的Cx43蛋白及其mRNA表達(dá)，但與RA聯(lián)合后，其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Cx43的影響與正常血清組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 桉葉油含藥血清聯(lián)合維甲酸作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平

表2 桉葉油含藥血清聯(lián)合RA作用體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43 mRNA相對(duì)RA組Pax3、Cx43 mRNA表達(dá)水平改變情況

3 討 論

RA是維生素A在體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功能，在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)胚胎的形成、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化起重要的調(diào)節(jié)作用。RA是一種很強(qiáng)的誘導(dǎo)分化劑，可誘導(dǎo)300多種功能蛋白質(zhì)的表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，小劑量RA可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。鐘德君等[5]觀察不同濃度的RA在鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化中的作用，發(fā)現(xiàn)RA具有顯著地促進(jìn)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化為神經(jīng)元的作用，且 1.0 μmol∕L RA 誘導(dǎo)分化效果最佳。蔣震偉等[6]用 10 μmol∕L RA 處理人胚神經(jīng)干細(xì)胞后，將神經(jīng)干細(xì)胞移植入受損的大鼠脊髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)能替代缺失的神經(jīng)元，能促進(jìn)受損的脊髓功能恢復(fù)。然而，RA也是致畸因子，過(guò)量的RA可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)管畸形、腭裂、骨質(zhì)疏松等等多種畸形。蔡煒嵩等[7]利用RA灌胃造大鼠神經(jīng)管畸形動(dòng)物模型觀察其出現(xiàn)神經(jīng)組織畸胎瘤、脊髓裂開(kāi)、脊柱裂等畸形形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)RA可干擾神經(jīng)發(fā)育導(dǎo)致脊柱裂、脊髓裂開(kāi)和神經(jīng)錯(cuò)構(gòu)瘤的發(fā)生。李紅麗等[8]用RA建立小鼠神經(jīng)管畸形模型，體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并檢測(cè)其增殖變化，發(fā)現(xiàn)胚胎早期神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目減少及神經(jīng)細(xì)胞增殖受抑制與RA致神經(jīng)管畸形的發(fā)生有密切關(guān)系。由于胚胎畸形發(fā)生是先天性的，一旦發(fā)生后具有不可逆性，故其治療方法主要以預(yù)防性治療為主。不少學(xué)者利用RA造胚胎致畸模型，通過(guò)研究藥物對(duì)其的拮抗作用，來(lái)尋找有效預(yù)防治療先天畸形的方法。本課題組前期研究中利用桉葉油聯(lián)合RA灌胃SD孕鼠，探討其在預(yù)防性治療胚胎畸形中是否具有藥用價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桉葉油對(duì)RA引起胎鼠畸形，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，骨骼發(fā)育及骨化遲緩有一定的拮抗作用[9-10]，對(duì)胎鼠腦組織的Cx43、Pax3蛋白和基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RA組胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白過(guò)度表達(dá)，桉葉油具有拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白表達(dá)的作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

Cx43是縫隙連接蛋白家族的重要成員，也是脊椎動(dòng)物中表達(dá)最多、最廣泛的縫隙連接蛋白。縫隙連接又稱通訊連接，是細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息傳遞的通道。該通道允許離子、小分子物質(zhì)等自由通過(guò)，傳遞細(xì)胞間的信息和能量，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)調(diào)控等各方面起著重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)尚未建立或未發(fā)育完善的早期胚胎，長(zhǎng)距離的信息傳遞難以進(jìn)行，胚胎各部分細(xì)胞的增殖、分化與生長(zhǎng)發(fā)育離不開(kāi)細(xì)胞間離子信息的交換，縫隙連接異常將導(dǎo)致細(xì)胞分化遷移異常。有研究表明，Cx43表達(dá)及其縫隙連接功能的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過(guò)程有密切的聯(lián)系[11]。REAUME等[12]發(fā)現(xiàn)，Cx43無(wú)義突變可造成信息傳遞缺陷，影響神經(jīng)細(xì)胞的遷移、增生及細(xì)胞凋亡過(guò)程。喻博等[13]用體外培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦損傷，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)腦損傷的恢復(fù)有一定作用，且與CX43的表達(dá)水平有關(guān)。WATANABE等[14]研究認(rèn)為，過(guò)量RA是通過(guò)增加Cx43 mRNA的表達(dá)上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá)，使信息傳遞發(fā)生紊亂，從而阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究用5 μmol∕L RA作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h，也發(fā)現(xiàn)RA具有上調(diào)細(xì)胞Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的作用，5%桉葉油含藥血清聯(lián)合RA作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)與單純RA組比較均顯著降低，提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)細(xì)胞Cx43 mRNA及其蛋白表達(dá)的作用，而單純的5%桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的Cx43 mRNA及其蛋白表達(dá)水平增加，此結(jié)果進(jìn)一步證明桉葉油含藥血清對(duì)RA上調(diào)細(xì)胞Cx43表達(dá)有拮抗作用，而非協(xié)同作用。Pax3基因?qū)儆赑ax基因家族，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)組織和器官的分化起著重要的調(diào)控作用。STOYKOVA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管細(xì)胞開(kāi)始分化之前，在整個(gè)神經(jīng)管軸的頂板、側(cè)翼板及神經(jīng)嵴細(xì)胞均有表達(dá)Pax3基因已表達(dá)。Pax3表達(dá)過(guò)高或過(guò)低均可導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，WU等[16]研究證明，神經(jīng)嵴細(xì)胞中Pax3的持續(xù)高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠腭裂和骨畸形。ZHOU等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Pax3能調(diào)節(jié)Soostdc1的表達(dá)從而阻止神經(jīng)嵴對(duì)骨形成蛋白的誘導(dǎo)，導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)脊柱裂或腦膨出。BURREN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏可致小鼠Pax3功能喪失，從而導(dǎo)致神經(jīng)管畸形。王濤等[19]用RA及?；撬峤⑿∈笊窠?jīng)管畸形及干預(yù)模型，發(fā)現(xiàn)RA的致畸作用與Pax3基因表達(dá)的時(shí)相差異性有關(guān)。KENNEDY等[20]用低劑量的RA處理P19或小鼠胚胎干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)RA是通過(guò)上調(diào)Wnt3a、PAX3、Meox1、MyoD 和 Myogenin的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)骨骼肌的成肌增強(qiáng)。本研究用5 μmol∕L RA作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的Pax3的表達(dá)也是增加的，RA聯(lián)合5%的桉葉油含藥血清作用細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的Pax3蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)細(xì)胞Pax3蛋白和mRNA表達(dá)的作用。

本研究表明，RA具有上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞Cx43、Pax3的表達(dá)，桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞Cx43、Pax3表達(dá)的作用。此結(jié)論與本課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論一致，從而進(jìn)一步證明了影響Cx43、Pax3的表達(dá)可能是桉葉油含藥血清具有拮抗RA致畸作用的機(jī)制之一。