張 鑫，黎 靜，魯 晴，黃華生，林毓君，唐春女，潘璐璐，莫書榮（廣西醫(yī)科大學生理教研室，廣西南寧 530021）

隨著我國人口數(shù)量的不斷增加，人口老齡化問題逐漸突出，因此衰老性疾病和亞健康的衰老性疾病等隨之而來?？顾ダ涎芯考叭绾晤A防和延緩年齡相關疾病的發(fā)生和發(fā)展將有利于提高人們的生活質量，減少其家庭的經(jīng)濟負擔，已逐漸成為醫(yī)學界關注的熱點。衰老最先表現(xiàn)為皮膚衰老，皮膚是人體最大的器官，由表皮、真皮和皮下組織構成，其中真皮為皮膚提供各種營養(yǎng)物質，成纖維細胞是真皮的主要細胞組成，維系著皮膚正常的生理結構和功能[1]。衰老的皮膚在結構和功能上將發(fā)生改變[2-3]。因此，皮膚成纖維細胞衰老模型在研究衰老機制、表現(xiàn)及篩選延緩衰老藥物起著重要作用。本研究旨在建立成纖維細胞（MSF）衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關疾病的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取5～7 d昆明乳鼠，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、Ⅰ型膠原酶（美國Invitrogen公司）、β-半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒（上海碧云天公司）、鼠抗Vimentin單克隆抗體（武漢博士德公司）、鼠抗Sirt1單克隆抗體（SANTA CRUZ公司）、逆轉試劑盒（Thermo公司）、液體DAB酶底物顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）。4，6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）（Solarbio公司）

1.2 方法

1.2.1 MSF的培養(yǎng) 取5～7 d的昆明乳鼠，用75%乙醇浸泡消毒30 min，用消毒過的手術剪分離乳鼠的背部皮膚5 cm×3 cm，將分離下來的皮膚置于10 cm的培養(yǎng)皿中，用含1%青霉素-鏈霉素的去離水磷酸鹽緩沖液（DPBS）清洗 2次，吸凈DPBS，去除血管脂肪，用手術剪將皮膚組織剪碎并將組織碎塊轉移到15 mL離心管內，然后加入10 mL的0.1%Ⅰ型膠原酶（無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基），并吹打使得皮膚組織碎塊分散，將離心管放入到CO2細胞培養(yǎng)箱中消化90 min，并且每隔30 min振蕩搖晃離心管1 min。消化完后離心機以1 500 r∕min速率離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM清洗2次，以1 000 r∕min離心速率離心3 min，棄上清，再用含15%胎牛血清的高糖DMEM重懸組織塊并用70 μm的濾篩過濾，將濾液轉移到培養(yǎng)瓶，并放入二氧化碳（CO2）細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2 MSF的鑒定 采用形態(tài)學觀察法觀察MSF的形態(tài)特征；Vimentin蛋白采用細胞免疫組化法分析MSF，具體方法如下，將培養(yǎng)板中長好MSF的玻片用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS清洗3次；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；加滴一抗波形蛋白抗體。用PBS清洗，滴加生物素標記的二抗，PBS沖洗。滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。DAB顯色，用蘇木素復染，用中性樹膠封固，在顯微鏡下采集圖像。

1.2.3 D-半乳糖誘導細胞衰老 將生長狀態(tài)良好的MSF接種于6孔板，用高糖DMEM培養(yǎng)基、37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞融合70%～80%，給予含有不同濃度 D-半乳糖（10、20、30 g∕L）的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、24、48 h。

1.2.4 β-半乳糖苷酶染色實驗 按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行實驗操作，具體方法如下：吸棄舊的培養(yǎng)基，用DPBS清洗1次，加入1 mL染色固定液，室溫固定15 min；吸棄固定液，用DPBS清洗3次，每次3 min；吸棄DPBS，每孔加入1 mL染色工作液，用保鮮膜蓋住6孔板，然后放置于37℃恒溫箱中孵育過夜。甘油封閉鏡下觀察，各組隨機計數(shù)400個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率（%）。

1.2.5 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測p53基因表達 D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導 MSF 0、24、48 h，采用Trizol法提取細胞總RNA并進行RT-PCR，采用熒光定量染料法檢測p53 mRNA表達水平（上游引物：AGTCCTTTGCCCTGAACTGC，下游引物：GCGGATCTT GAGGGTGAAAT），每個樣本重復測量3次，以GAPDH（上游引物：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，下游引物：AGCCTTCTCCA TGGTGGTGAAGAC）為內參參照標準，按照2－△△Ct計算p53基因相對表達量。

1.2.6 細胞免疫熒光觀察Sirt1基因在MSF中的表達 D-半乳糖（20 g∕L）分別誘導 MSF 0、48 h，將培養(yǎng)板中爬好MSF的玻片用PBS清洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定爬片15 min，用PBS清洗3次，每次3 min；0.5%Triton X-100室溫通透20 min；用PBS清洗3次，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，并滴入足量稀釋好的一抗小鼠單克隆抗體Sirt1，放入濕盒，在4℃孵育過夜；用PBST浸洗爬片3次，并吸干液體，滴入稀釋好的熒光二抗，黑暗條件下20～37℃濕盒孵育1 h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，用PBST清洗；用含抗熒光淬滅劑的封片液封閉，在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗均重復3次，計量資料以表示，應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。多組間比較應用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察MSF形態(tài)學變化 光鏡下可見細胞胞體較大，胞核較大呈橢圓形，染色質疏松著色淺，核仁明顯，為多突的梭形或星形的扁平細胞，具有突起，符合皮膚MSF的形態(tài)學特征。見圖1。

圖1 原代成纖維細胞形態(tài)及鑒定（4×）

2.2 Vimentin蛋白免疫組織化學分析 Vimentin蛋白免疫組織化學結果顯示，原代培養(yǎng)細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達。見圖2。

圖2 MSF Vimentin蛋白免疫組化分析（4×）

2.3 β-半乳糖苷酶染色分析 β-半乳糖苷酶染色后，衰老細胞呈藍色，陰性細胞無著色。不同濃度D-半乳糖誘導MSF 0、24、48 h后，陽性細胞的百分比均顯著高于0 g∕L，并且呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性。見圖3、4。

圖3 不同濃度D-半乳糖誘導MSF后β-半乳糖苷酶染色情況（100×）

圖4 不同濃度D-半乳糖誘導MSF后β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數(shù)分析

2.4 p53基因表達水平檢測 D-半乳糖誘導24、48 h后MSF p53 mRNA表達較0 h時表達顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 D-半乳糖誘導衰老后MSF中p53基因表達變化情況

2.5 Sirt1細胞免疫熒光檢測 細胞免疫熒光分析細胞Sirt1蛋白表達，Sirt1標記為綠色，DAPI標記細胞核為藍色熒光，融合后，發(fā)生重疊，Sirt1主要表達在細胞核，但是D-半乳糖誘導48 h后Sirt1的表達明顯降低。見圖6。

圖6 皮膚MSF Sirt1免疫熒光染色結果（200×）

3 討 論

細胞衰老是指細胞在執(zhí)行生命活動過程中隨著時間的推移，細胞增殖分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程，是正常細胞的必然歸宿[4]。衰老細胞雖然仍保留一些細胞的基本代謝活性，但在細胞形態(tài)和功能上都已發(fā)生了很多根本性的改變。例如，細胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內折，細胞器數(shù)量減少，胞內出現(xiàn)脂褐素等異常物質沉積。衰老細胞同樣擁有一些共同特點，主要表現(xiàn)在細胞增殖抑制、細胞周期阻滯、β-半乳糖苷酶活性增高等細胞功能的一系列變化[5]。目前，有研究表明，D-半乳糖所致衰老與自然衰老變化相似[6]。D-半乳糖是體內正常的營養(yǎng)成分，能夠通過轉變?yōu)槠咸烟牵瑓⑴c正常能量的代謝，如果D-半乳糖攝入過量則會導致機體多器官功能代謝紊亂，甚至產(chǎn)生對基因的表達和調控情況[7]。D-半乳糖使機體產(chǎn)生大量自由基，抗氧化能力減弱，脂質水平增加，從而導致機體引起亞急性衰老[8]。D-半乳糖衰老模型的涉及領域較廣，不僅涵蓋器官、組織和細胞形態(tài)學改變，還在信號通路的蛋白基因水平上均有研究[9]，已成為研究衰老的經(jīng)典細胞模型。

p53基因是一種與細胞生長、凋亡、衰老和DNA修復相關的重要基因。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制p53基因的表達可以減少皮膚細胞的凋亡，并且延緩皮膚的衰老[10-12]。Sirt1基因是酵母長壽基因Sirt2的同源基因，參與了基因轉錄、能量代謝及細胞衰老等生理功能調節(jié)，Sirt1通過與蛋白的相互作用可抑制p53基因表達來調控細胞的凋亡進程，從而發(fā)揮對基因的調控作用[13]。在衰老過程中，Sirt1表達水平的降低可以增強p53的表達，從而加速細胞的凋亡和衰老[14]。

在衰老過程中，MSF的功能、形態(tài)和增殖潛力等方面發(fā)生了顯著變化，并對皮膚的功能及穩(wěn)態(tài)具有重要影響[15]。本研究采用Ⅰ型膠原酶消化法原代分離獲得MSF，在倒置顯微鏡下觀察細胞呈紡錘形或星形的扁平細胞，符合皮膚成纖維細胞的形態(tài)學特征。同時，原代培養(yǎng)細胞中Vimentin蛋白呈陽性表達，進一步提示原代分離培養(yǎng)的細胞為MSF。本研究通過D-半乳糖法建立細胞衰老模型，結果表明，D-半乳糖作用MSF后，可使MSF β-半乳糖苷酶陽性染色細胞數(shù)量明顯增多、p53基因表達增強、Sirt1基因表達降低等細胞衰老的相關表現(xiàn)。

綜上所述，本實驗通過Ⅰ型膠原酶消化法建立了MSF培養(yǎng)方法，并通過D-半乳糖誘導法建立了MSF衰老模型，為開展皮膚衰老及老年相關疾病的研究提供了實驗基礎。