孫曉玲

(長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)分院，長春 130033)

生姜是姜科草本植物，是我國傳統(tǒng)常用調(diào)味料之一，具有散寒、健胃、驅(qū)風(fēng)、止吐等能效[1]。研究證明生姜中含有生姜油、姜辣素、黃酮和多糖類等生物活性成分，具有抗菌、抗氧化、降血脂等功能[2-5]。其中黃酮類化合物廣泛存在于天然產(chǎn)物中，是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。 黃酮類化合物可改善血管的通透性，降低血脂和膽固醇，防治老年高血壓等，是人們?nèi)找娼邮艿囊环N天然活性成分。研究顯示生姜中的黃酮成分主要為雙羥黃酮，其提取液具有良好的抗氧化活性，對不同自由基具有良好的清除作用，能有效抑制油脂的氧化；生姜黃酮還具有一定的抑菌作用，對食品常見污染菌有一定的抑制作用[6，7]。目前應(yīng)用于提取生姜總黃酮的方法主要有浸提法、回流提取法和超聲提取法。上述提取方法主要利用不同高濃度的乙醇和甲醇，本文應(yīng)用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮，考察了纖維素酶添加量、乙醇濃度、固液比等因素對黃酮提取率的影響，并通過優(yōu)化試驗確定最優(yōu)提取工藝，建立適合于生產(chǎn)應(yīng)用的生姜總黃酮的提取工藝，為其實(shí)際生產(chǎn)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜：市售；纖維素酶：信得利生物工程有限公司；蘆?。褐袊幤飞镏破窓z定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑：均為分析純。

KQ-500E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SC-3610 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.2 纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜黃酮

生姜樣品處理方法：生姜用清水沖洗干凈后，切成薄片，40 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎后過40目篩得提取實(shí)驗樣品。

纖維素酶-乙醇提取方法：稱取生姜樣品1.00 g，加入適當(dāng)濃度乙醇溶液，置于水浴鍋內(nèi)加溫至設(shè)定溫度后，用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)整pH值，添加一定量的纖維素酶，保持恒溫酶解提取一定時間后，在沸水浴上滅酶10 min，經(jīng)4000 r/min速度離心10 min，取上清液備用。

1.3 單因素試驗和正交試驗設(shè)計

試驗中以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，選擇主要影響因素進(jìn)行考察，包括乙醇濃度、酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH、固液比6個因素。

選用正交試驗設(shè)計對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以總黃酮提取率為評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上確定需要進(jìn)行優(yōu)化的試驗條件，從而確定纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的最佳工藝條件。

1.4 總黃酮測定方法

參考《保健食品功效成分檢測方法》測定樣品中總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，并以30%乙醇為溶劑，配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[8]。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，靜置5 min后，加入0.4 mL硝酸鋁溶液(10%)，放置6 min后加入4 mL氫氧化鈉溶液(4%)，用30%乙醇定容后混勻，靜置10 min，在510 nm波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=10.12x-0.0032，mg/mL，相關(guān)系數(shù)r2=0.9989。

1.5 總黃酮提取率計算方法

生姜中黃酮含量的計算公式如下，以干燥后生姜樣品計算，單位為g/100 g。

式中：X為生姜樣品中黃酮的含量，g/100 g;m為生姜樣品的質(zhì)量，g；C為生姜提取液中的黃酮濃度，mg/mL；F為稀釋倍數(shù)。

1.6 超聲法提取生姜總黃酮

稱取樣品適量，以80%的乙醇為溶劑，按照料液比為1∶40(g/mL)加入溶劑，超聲波提取時間2 h，4000 r/min離心5 min，取上清液測定。

1.7 回流提取法

稱取樣品適量，以80%的乙醇水溶液為溶劑，固液比為1∶2，在80 ℃下回流3 h，4000 r/min離心5 min，取上清液測定。

1.8 生姜總黃酮清除羥自由基活性的測定

樣品測定液的制備：稱取姜粉10.00 g，按照不同方法的最優(yōu)提取工藝提取生姜總黃酮，濾液減壓濃縮回收乙醇后，真空干燥得提取物；以水為溶劑，制備濃度為25 μg/mL的待測液備用。

清除羥自由基活性的測定：取分別加入1.5 mL的2 mmol/L 硫酸亞鐵、30 mmol/L過氧化氫、6 mmol/L水楊酸，混合后將試管放入37 ℃水浴中，加熱15 min后取出，在λ=510 nm處測量其吸光度值A(chǔ)1；然后加入不同提取方法提取的生姜總黃酮溶液2.0 mL，混勻，置于37 ℃水浴加熱15 min，取出放置于室溫下，測其吸光度值A(chǔ)2。以蒸餾水作空白對照，以2 mL樣品液加4.5 mL蒸餾水作為參比并測其吸光度值A(chǔ)3，已消除樣品液中物質(zhì)對吸光值的干擾[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇濃度的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為0，10%，20%，30%，40%，50%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h。同時做不同濃度乙醇生姜粉提取液的對照樣，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.1 The effects of ethanol volume fraction on the yields of total flavonoids

由圖1可知，與乙醇浸提法(對比法)相比，纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取姜粉總黃酮提取率高于對比方法，說明纖維素酶的加入更有利于原料基質(zhì)中黃酮成分的溶出，提高目標(biāo)成分的提取效率。分析圖1中曲線可知，當(dāng)乙醇濃度在0～30%之間時，姜粉總黃酮提取率隨乙醇濃度的增大而增加，酶解作用和乙醇浸提作用同時發(fā)揮，起到正向協(xié)同的作用；當(dāng)乙醇濃度增大到50%時，總黃酮提取率降低，與浸提法基本一致。推測是因為高濃度的乙醇溶液對酶活性有所抑制，影響酶解作用的發(fā)揮，乙醇浸提工藝發(fā)揮主導(dǎo)作用。因此在優(yōu)化試驗中，乙醇濃度確定在25%～35%之間。

2.2 pH的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，分別調(diào)節(jié)pH到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0后，按照干燥樣品粉末計為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 提取液pH值對總黃酮提取率的影響Fig.2 The effects of pH value of extracting solution on the yields of total flavonoids

由圖2可知，在pH 4～6的范圍內(nèi)，姜粉總黃酮提取率波動范圍不大，在0.50%～0.65%之間。當(dāng)pH為5.0時，姜粉總黃酮為0.65%，達(dá)到最大值；繼續(xù)增大pH，總黃酮提取率反而降低。這是因為pH會影響纖維素酶的活性，而其活性又會影響酶解作用的發(fā)揮。纖維素酶的最適合酶解pH一般在4.5～6.0之間，在本試驗的基質(zhì)體系中，最適pH為5.0。在后續(xù)優(yōu)化試驗中，確定反應(yīng)體系pH為5.0。

2.3 酶添加量的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計為0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 酶添加量對總黃酮提取率的影響Fig.3 The effects of enzyme dosage on the yields of total flavonoids

由圖3可知，反應(yīng)體系因為纖維素酶的參與，總黃酮提取率增加，高于未添加纖維素酶的試驗對照組。隨著酶添加量的增加，生姜總黃酮提取率增加到0.67%，但當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到1%后，總黃酮提取率增長緩慢，酶添加量與姜粉質(zhì)量達(dá)到平衡，因此優(yōu)化試驗中，酶添加量確定在0.5%～1.5%之間。

2.4 反應(yīng)溫度的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計為1.0%的添加量，加入纖維素酶，分別在30，40，50，60 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 The effects of extraction temperature on the yields of total flavonoids

由圖4可知，隨反應(yīng)體系溫度的升高，姜粉總黃酮提取率隨之增加。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時，姜粉總黃酮提取率達(dá)到最高值0.64%。繼續(xù)提高溫度未能起到提高總黃酮提取率的作用，溫度低于50 ℃，不利于纖維素酶活性的發(fā)揮。因此在優(yōu)化試驗中，確定酶解溫度為50 ℃。

2.5 固液比的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下提取1 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 固液比對總黃酮提取率的影響Fig.5 The effects of solid-liquid ratio on the yields of total flavonoids

由圖5可知，姜粉總黃酮提取率隨溶劑用量的增加而增加。增加溶劑用量可以增大基質(zhì)與溶劑的接觸面積，有利于總黃酮成分的浸出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時，總黃酮提取率增大幅度減慢，因此選擇固液比1∶20，1∶30和1∶40為優(yōu)化試驗固液比的3個水平。

2.6 提取時間的確定

稱取生姜粉1.00 g，按照固液比1∶20，分別加入濃度為30%的乙醇溶液，調(diào)節(jié)pH到5.0后，按照干燥樣品粉末計為1.0%的添加量，加入纖維素酶，在50 ℃下分別提取1，1.5，2，2.5，3 h，得總黃酮提取率，結(jié)果見圖6。

圖6 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.6 The effects of extraction time on the yields of total flavonoids

由圖6可知，隨著提取時間的延長，姜粉總黃酮提取率不斷增加，給反應(yīng)體系目標(biāo)成分溶出足夠的時間。但當(dāng)提取時間達(dá)到2 h后，總黃酮提取率明顯高于1 h時總黃酮提取率，并基本達(dá)到穩(wěn)定；繼續(xù)延長提取時間，總黃酮提取率增長緩慢，因此，確定2 h為最佳提取時間。

2.7 最優(yōu)提取條件的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定在優(yōu)化試驗中選擇乙醇濃度、酶添加量和固液比為考察因素，利用正交試驗設(shè)計法采用L9(34) 正交表進(jìn)行試驗設(shè)計，其他提取參數(shù)分別為提取溫度50 ℃、提取時間2 h，pH5.5，正交試驗因素、水平和結(jié)果分析見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 L9(34) 正交試驗直觀分析表Table 1 Results of L9(34) orthogonal experiment intuitive analysis

續(xù) 表

由表1可知，影響生姜總黃酮提取率的主次因素為B>A>D，即酶添加量>乙醇濃度>固液比；確定總黃酮的最佳提取條件組合為A3B3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，酶添加量為1.5%，固液比為1∶40。

表2 正交試驗方差分析表Table 2 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由表2方差分析結(jié)果可知，在纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的優(yōu)化試驗中，考察的3個因素對試驗結(jié)果均無顯著性影響，主要是因為考察因素水平設(shè)置的較接近最優(yōu)條件，梯度范圍較小的原因，從而使得因為因素水平變化引起得率波動范圍相對較小。

根據(jù)單因素試驗和正交試驗的結(jié)果，確定纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，pH值為5.0，酶添加量為1.5%，提取溫度為50 ℃，固液比為1∶40，提取時間為2 h。按照此條件重復(fù)進(jìn)行6次驗證試驗，可得姜粉總黃酮平均提取率為0.79%，RSD為0.431%。結(jié)果證明纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜粉總黃酮成分提取率高、提取效果穩(wěn)定。

2.8 3種提取方法的對比分析

分別采用纖維素酶-乙醇結(jié)合法、超聲提取法和回流法提取姜粉總黃酮，得總黃酮提取率分別為0.79%，0.72%，0.73%。由此可知3種提取法所得結(jié)果相近，提取率均高于0.7%。對比分析3種提取方法，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法提取時間比回流提取法短1 h；對比超聲提取法，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和回流法更易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；從能耗角度分析，纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法能耗較低。綜上分析可得應(yīng)用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮具有提取率高、提取時長較合理、能耗低、適合工業(yè)化生產(chǎn)和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

2.9 羥自由基清除活性

選取羥自由基清除法測定生姜的抗氧化性質(zhì)，并對比分析3種提取方法生姜提取物和抗氧化劑Vc的羥自由基清除活性，結(jié)果見圖7。

圖7 不同提取方法生姜總黃酮提取率和羥自由基清除活性的對比Fig.7 Comparison of extraction rates and hydroxyl radical scavenging activities of flavonoids in ginger by different extraction methods

注：1為纖維素酶-乙醇結(jié)合法；2為超聲提取法；3為回流提取法。

由圖7可知，不同提取方法生姜總黃酮提取物對羥自由基清除能力的大小分別為纖維素酶-乙醇結(jié)合法>超聲法>Vc>回流法。由此可知，3種提取方法獲得的生姜提取物具有較好的羥自由基清除活性，其中纖維素酶-乙醇結(jié)合法和超聲提取法獲得的生姜提取物的羥自由基清除活性高于Vc，說明生姜提取物具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文選用纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮，發(fā)揮纖維素酶酶解樣品基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，結(jié)合乙醇的滲透和溶出作用實(shí)現(xiàn)生姜總黃酮的高效提取。利用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化設(shè)計確定最優(yōu)提取條件。單因素實(shí)驗中考察了纖維素酶添加量、酶解時間、酶解溫度等6個主要影響因素對生姜粉總黃酮提取率的影響。在此基礎(chǔ)之上確定酶添加量、乙醇濃度和固液比為優(yōu)化試驗中的考察因素，并確定了最優(yōu)提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，pH為5.0，酶添加量為1.5%，提取溫度為50℃，固液比為1∶40，提取時間為2h。在最優(yōu)條件下，纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮的得率為0.79%，高于超聲提取法和回流提取法。纖維素酶-乙醇結(jié)合法提取生姜總黃酮提取物的羥自由基清除活性也高于VC、超聲提取物和回流提取物。以上研究結(jié)果證明，纖維素酶-乙醇結(jié)合法可以較好地實(shí)現(xiàn)生姜總黃酮的高效提取，更好地保持其生物活性。