鄧維琴，陳功,2，張其圣,2，張帥，楊國華，李峰，李恒,2*

(1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，成都 611130；2.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030；3.四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司，成都 611732)

郫縣豆瓣醬是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，食用鹽、小麥粉等為輔料釀制而成的，具有色紅褐、油潤、醬酯香、瓣粒香脆、味鮮辣等特點(diǎn)[1]。其生產(chǎn)工藝主要包括制曲、甜瓣子發(fā)酵、辣椒坯發(fā)酵及混合后發(fā)酵生香等階段[2,3]。豆瓣醬的發(fā)酵過程中會(huì)分解原料中的蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生醇、酸、酯等呈味物質(zhì)，賦予豆瓣醬獨(dú)特的色澤、香氣、滋味、形態(tài)，使豆瓣醬營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特[4]。在豆瓣醬的發(fā)酵過程中，原料中的成分在微生物代謝產(chǎn)生的各種酶的作用下分解和重組，生成了各種活性物質(zhì)、纖溶酶、呋喃酮類化合物和類黑精素等。發(fā)酵豆瓣醬具有促進(jìn)機(jī)體代謝；調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)消化；抗氧化；預(yù)防肝癌等保健作用[5-8]。目前豆瓣醬主要分為紅油豆瓣和特級(jí)豆瓣，有的特級(jí)豆瓣發(fā)酵時(shí)間較長，有的甚至達(dá)到5年的時(shí)間，這些長時(shí)間發(fā)酵的豆瓣風(fēng)味較好，受到消費(fèi)者的喜愛。

評(píng)價(jià)郫縣豆瓣品質(zhì)等級(jí)的依據(jù)包括色澤、香氣、滋味等感官指標(biāo)以及水分、氨基酸態(tài)氮、總酸等理化指標(biāo)。由于發(fā)酵過程中各種微生物代謝、蛋白酶的分解作用、理化反應(yīng)等，郫縣豆瓣的水分、總酸、氨基酸態(tài)氮、氨基酸等理化指標(biāo)會(huì)隨之發(fā)生變化[9-11]；亦有報(bào)道指出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，郫縣豆瓣中的風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)出差異[12]。

對(duì)“川菜之魂”——郫縣豆瓣醬的品質(zhì)分析是極為重要的工作。目前關(guān)于不同發(fā)酵時(shí)長郫縣豆瓣醬(尤其是長時(shí)間發(fā)酵的豆瓣醬)的理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)等的研究報(bào)道較少，亦缺乏各指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系分析。

本文旨在通過對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間(長時(shí)間發(fā)酵，長達(dá)96個(gè)月)的郫縣豆瓣醬的理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)等因素的測定，揭示隨發(fā)酵時(shí)間的變化郫縣豆瓣醬的品質(zhì)差異，為不同發(fā)酵時(shí)間豆瓣醬的品質(zhì)分析提供了數(shù)據(jù)參考，對(duì)長時(shí)間發(fā)酵豆瓣醬獨(dú)特品質(zhì)的認(rèn)可和推廣起著促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵10個(gè)月的豆瓣醬、發(fā)酵24個(gè)月的豆瓣醬、發(fā)酵36個(gè)月的豆瓣醬、發(fā)酵54個(gè)月的豆瓣醬、發(fā)酵96個(gè)月的豆瓣醬：均取自四川省郫縣鵑城豆瓣有限公司。

NaOH、鹽酸、苯酚、甲醛：均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

6890N-5973i氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；30/50 μm DVB/Carboxen/PDMS固相微萃取頭及手柄 北京八方世紀(jì)科技有限公司；雷磁pH SJ-4F計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 HATACHI(日本日立)公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測定

水分含量的測定：參照國標(biāo)GB 5009.3-2010[13]的方法；

總酸的測定：參照國標(biāo)GB/T 5009.39-2003的方法[14]。

氨基酸態(tài)氮的測定：參照國標(biāo)GB/T 5009.40-2003的方法[15]。

氨基酸總量的測定：參照國標(biāo)GB 5009.124-2016的方法[16]。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用2010 Utra GC-MS(SHIMADIU 公司)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，分析不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。

準(zhǔn)確稱取2 g粉碎的樣品，放入15 mL 的樣品瓶中，將樣品瓶放入60 ℃水浴中預(yù)熱2 min，然后將萃取針頭插入樣品瓶中，60 ℃恒溫頂空萃取40 min 后，插入GC-MS 進(jìn)樣口解吸5 min，然后檢測分析。

檢測條件：DB-WAX 毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為氦氣，流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，以6 ℃/min升至85 ℃(保留1.5 min)，再以2.5 ℃/min升至148 ℃(保留1 min)，以5 ℃/min 升至220 ℃(保持2 min)，最后以10 ℃/min升至250 ℃。質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～350 amu；檢測器電壓0.1 kV；調(diào)諧文件stuneu；掃描模式scan。

揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果由NIST05譜庫檢索與人工圖譜解析共同確定，保留指數(shù)的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)進(jìn)行，化合物相對(duì)含量的確定采用面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分

郫縣豆瓣醬的晾曬時(shí)間與水分含量的關(guān)系見圖1。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬中水分含量Fig.1 Water content of broad bean sauce in different fermentation time

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，豆瓣醬中水分含量呈逐漸減少趨勢，由10個(gè)月時(shí)的58%降至96個(gè)月時(shí)的45%。即發(fā)酵時(shí)間越長，郫縣豆瓣醬中的水分含量越低。國標(biāo)規(guī)定，特級(jí)豆瓣醬、一級(jí)豆瓣醬、二級(jí)豆瓣醬的水分含量應(yīng)當(dāng)分別小于53%，57%和60%。結(jié)果顯示：本試驗(yàn)所取5份樣品均滿足二級(jí)豆瓣醬對(duì)水分的要求，但僅發(fā)酵時(shí)長達(dá)到36個(gè)月后的樣品(水分含量為52.44%)滿足特級(jí)豆瓣醬的要求。

2.2 總酸

豆瓣醬的晾曬時(shí)間與總酸含量的關(guān)系見圖2。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬中總酸含量Fig.2 Total acid content of broad bean sauce in different fermentation time

由圖2可知，豆瓣醬中總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈總體增加趨勢。其中，10～24個(gè)月期間總酸含量略有降低；發(fā)酵24個(gè)月以后豆瓣醬中的總酸含量逐漸增加，發(fā)酵96個(gè)月后達(dá)2.25 g/kg?？偹岷康脑黾涌赡苁侨樗峋任⑸锎x產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致有機(jī)酸逐漸積累，酸度逐漸增加。

2.3 氨基酸態(tài)氮

豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量與發(fā)酵時(shí)長的關(guān)系見圖3。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量Fig.3 Amino acid nitrogen of broad bean sauce in different fermentation time

由圖3可知，郫縣豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量隨其發(fā)酵時(shí)間延長逐漸增加，其含量由10個(gè)月時(shí)的0.27 g/100 g增加至96個(gè)月時(shí)的0.49 g/100 g。本試驗(yàn)的各樣品中氨基酸態(tài)氮含量均高于國標(biāo)規(guī)定特級(jí)豆瓣醬的氨基酸態(tài)氮含量(≥0.25 g/100 g)。氨基酸態(tài)氨是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，它能使郫縣豆瓣醬鮮味柔和，改善色澤，調(diào)和香氣，氨基酸態(tài)氮是評(píng)價(jià)郫縣豆瓣醬質(zhì)量的重要因素之一。原料中的蛋白質(zhì)含量及蛋白酶含量對(duì)豆瓣醬產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮含量有極大的影響。由本試驗(yàn)結(jié)果可知各試驗(yàn)樣品的氨基酸態(tài)氮含量均達(dá)到較高水平，且隨發(fā)酵時(shí)間的增加，由于蛋白酶的持續(xù)分解作用使豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，豆瓣醬品質(zhì)也因氨基酸態(tài)氮含量增加而提升。

2.4 氨基酸

豆瓣醬中氨基酸含量與發(fā)酵時(shí)長的關(guān)系見圖4。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬氨基酸總量Fig.4 Total content of amino acid of broad bean sauce in different fermentation time

由圖4可知，郫縣豆瓣醬中氨基酸總量隨其發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增加，經(jīng)過96個(gè)月的發(fā)酵，其中氨基酸總量達(dá)到7.63 g/100 g。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬中氨基酸組分分析Fig.5 Analysis of amino acid components of broad bean sauce in different fermentation time

由圖5可知，各發(fā)酵時(shí)長的豆瓣醬中均檢出谷氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等18種氨基酸，且均以谷氨酸和天門冬氨酸含量最高，且含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增加，對(duì)豆瓣醬的鮮味貢獻(xiàn)很大。天門冬氨酸由10個(gè)月時(shí)的0.65 g/100 g增加到8年的0.94 g/100 g；谷氨酸10個(gè)月的含量是1.14 g/100 g，發(fā)酵8年的豆瓣醬中其含量增加到1.4 g/100 g。各試樣中的氨基酸是在發(fā)酵體系中蛋白酶系分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的，逐漸積累，因此也使得其中氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。但由于美拉德反應(yīng)會(huì)消耗氨基酸，因此長時(shí)間發(fā)酵的豆瓣醬中氨基酸含量增加的趨勢較為緩慢。

2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

不同發(fā)酵時(shí)間豆瓣醬中風(fēng)味物質(zhì)的種類見圖6。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)長豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類Fig.6 Analysis of the species of volatile flavor substances of broad bean sauce in different fermentation time

由圖6可知，發(fā)酵10個(gè)月的豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共143種，其中醇類物質(zhì)32種，酯類物質(zhì)36種；2年豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共158種，其中醇類物質(zhì)35種，醛類物質(zhì)36種；3年豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共170種，其中醇類物質(zhì)36種，酯類物質(zhì)26種，酮類物質(zhì)共24種；4.5年豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共137種，其中醇類物質(zhì)28種，烷類物質(zhì)21種；8年豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共120種，其中醇類物質(zhì)21種，酮類物質(zhì)18種。本試驗(yàn)鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類遠(yuǎn)多于同類研究報(bào)道的郫縣豆瓣醬中的53種和66種。

圖7 豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流圖Fig.7 GC-MS total ion flow graphs of volatile flavor substances of broad bean sauce in different fermentation time

注：a為10個(gè)月；b為24個(gè)月；c為36個(gè)月；d為54個(gè)月；e為96個(gè)月。

本試驗(yàn)優(yōu)化了萃取方法和檢測條件，采用的萃取溫度較高(60 ℃)，且檢測升溫程序較慢，最終溫度達(dá)到250 ℃，由總離子色譜圖(見圖7)可知，本試驗(yàn)采用的方法分離度好，高溫條件下分離檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類多，檢測效果好。

豆瓣醬樣品中相對(duì)含量較高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量見表1。其中，4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基-苯酚、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、3-呋喃甲醇、苯乙醇、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、3-甲基-丁酸、壬酸、(R)-(+)-香茅酸、辛酸、正葵酸、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、二十一烷、十八烷、3-甲基-十四烷、十六烷等物質(zhì)為各豆瓣醬樣品共有的風(fēng)味物質(zhì)；其中，苯甲醛、4-乙基-苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、芳樟醇、苯乙醇、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛相對(duì)含量較高，表明這些物質(zhì)可能是郫縣豆瓣醬的主要風(fēng)味來源，這與Li 等[17]的研究結(jié)果一致。李治華等測定的以成熟1年為代表的傳統(tǒng)豆瓣醬和商業(yè)豆瓣醬中共有的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、水楊酸甲酯，在本試驗(yàn)不同年限豆瓣醬中均有檢出[18]。張玉玉等分析不同年份豆瓣醬得出3個(gè)月、1年、3年的豆瓣醬中共有的主要揮發(fā)性成分為苯甲醛、苯乙醛、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、4-乙基愈創(chuàng)木酚、十七烷、十六酸乙酯，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間豆瓣醬中揮發(fā)性成分表Table 1 Volatile components of broad bean paste in different fermentation time

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

注：“-”表示未檢出。

另外一部分風(fēng)味物質(zhì)如乙基苯乙醇、1-庚基-環(huán)戊烯、水楊酸甲酯、異佛爾酮、苯乙酮、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、2-戊基-呋喃等則僅出現(xiàn)在2年和3年的豆瓣醬中，其他發(fā)酵時(shí)長的豆瓣醬中均未檢出?？梢哉J(rèn)為，這些物質(zhì)是豆瓣發(fā)酵過程中產(chǎn)生的非特征性成分，對(duì)豆瓣醬的風(fēng)味影響不大；而丁酸，2-甲基-戊酯、2-乙基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇、1-((1-丁氧基-丙-2-基)氧基)丙-2-基異丁基碳酸酯、2-哌啶酮等物質(zhì)在長時(shí)間(36～96個(gè)月)發(fā)酵豆瓣醬中才檢出，1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、苯乙醛、丁酸，2-甲基-戊酯等風(fēng)味物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長含量逐漸增加，廣受消費(fèi)者青睞的陳年豆瓣醬特有風(fēng)味可能正是來源于此類物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

本研究首次對(duì)不同年份尤其是長時(shí)間發(fā)酵(54，96個(gè)月)的豆瓣醬的理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定以分析發(fā)酵時(shí)長對(duì)郫縣豆瓣醬品質(zhì)的影響。理化指標(biāo)測定結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，郫縣豆瓣醬的水分含量逐漸降低，而氨基酸態(tài)氮和氨基酸含量則逐漸積累增加。另外，豆瓣醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類隨發(fā)酵時(shí)間延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，發(fā)酵36個(gè)月的豆瓣醬風(fēng)味物質(zhì)種類最多(170種)。其中，醇類、酸類、酯類、酮類、醛類和烷烴類物質(zhì)較多，與已有的研究結(jié)果較一致。其中4-乙基-2-甲氧基-苯酚和4-乙基-苯酚、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮在不同年份樣品中均有檢出，為主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。丁酸，2-甲基-戊酯、2-乙基-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲醇、1-((1-丁氧基-丙-2-基)氧基)丙-2-基異丁基碳酸酯、2-哌啶酮等是長時(shí)間發(fā)酵豆瓣醬(54，96個(gè)月)所獨(dú)有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，賦予長時(shí)間發(fā)酵豆瓣醬不同的風(fēng)味。綜合試驗(yàn)分析，長時(shí)間發(fā)酵的豆瓣醬營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味更佳，值得進(jìn)一步對(duì)其安全性進(jìn)行分析并推廣。

此外，長時(shí)間發(fā)酵豆瓣醬風(fēng)味的形成是各種微生物、酶綜合作用的結(jié)果，同時(shí)伴隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，會(huì)消耗體系中的還原糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、呋喃酮類化合物和類黑精素等，影響豆瓣醬的風(fēng)味和色澤。隨著豆瓣醬發(fā)酵時(shí)間延長，各種反應(yīng)產(chǎn)物的含量及種類都有變化，本研究僅對(duì)氨基酸態(tài)氮、氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等進(jìn)行分析，對(duì)美拉德反應(yīng)條件及反應(yīng)產(chǎn)物沒有進(jìn)行研究。此外，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成與假單胞菌、醋酸菌、乳酸菌等微生物的作用息息相關(guān)[19,20]，但這些微生物在長時(shí)間發(fā)酵豆瓣醬中的存活情況及代謝情況有待進(jìn)一步研究。