陳永敢，李珍，邢增葵，張來(lái)軍，黃海*

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，海南 三亞 572022；2.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022)

傳統(tǒng)蝦醬發(fā)酵將小蝦經(jīng)簡(jiǎn)單挑選并清洗后，加入適量食鹽，拌勻浸沒(méi)缸中，隨后置于自然環(huán)境中日曬夜露，利用蝦體內(nèi)源或環(huán)境菌群的蛋白酶、糖化酶等催化，1個(gè)月左右可完成發(fā)酵[1]。發(fā)酵后的蝦醬微紅、細(xì)膩。由于傳統(tǒng)蝦醬發(fā)酵一般只將蝦體進(jìn)行清洗，一定程度上去除了部分菌群，但多數(shù)蝦體上的微生物并沒(méi)有去除[2,3]。此外，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程并無(wú)特別除菌步驟，與外界環(huán)境密切接觸，在一定程度上不可避免地使蝦醬中有微生物生長(zhǎng)。因此，環(huán)境差異造成了參與發(fā)酵菌群的差異，這些微生物生長(zhǎng)必然產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，從而影響風(fēng)味[4]。然而以我國(guó)南海小型蝦制作的蝦醬中存在何種可培養(yǎng)的細(xì)菌至今鮮有報(bào)道。本研究收集我國(guó)南海蝦醬，分離可培養(yǎng)細(xì)菌并純化，提取基因組DNA，擴(kuò)增16S rDNA片段，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析不同菌株間的遺傳關(guān)系，為了解我國(guó)南海蝦醬中可培養(yǎng)微生物的類群提供了參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、氯化鈉等：均為國(guó)產(chǎn)分析純。2016年2月～2018年2月收集了6份蝦醬樣品，分別來(lái)自海南樂(lè)東(HL1801，YGH1601)、海南三亞(SY1601)、海南定安(DA1601)、海南文昌(WC1601)、廣東臺(tái)山(GD1601)。

1.2 主要儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠；無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 菌株的分離及純化保藏

蝦醬做系列稀釋，取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 20.0軟件用Duncan檢驗(yàn)判定組間差異，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。菌落劃線純化，重復(fù)3次。

1.4 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基因組DNA的提取及目的片段擴(kuò)增參照Chen等的方法[5]。采用引物A8-27f和B1523-1504r擴(kuò)增16S rDNA片段[6]，PCR產(chǎn)物委托北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

根據(jù)菌株16S rDNA的測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行Blast比對(duì)，搜索同源序列。選取不同種的代表性菌株進(jìn)行分析，采用ClustalX 1.83將序列對(duì)齊，利用MEGA 5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并以自展法(Bootstrap)進(jìn)行檢測(cè)，循環(huán)1000次，采用鄰接法、最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[7，8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 南海蝦醬中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與純化

6種蝦醬以淡紫色或淡黃色為主，呈稠糊狀，含細(xì)顆粒。利用這6種蝦醬進(jìn)行稀釋涂布，獲得每種蝦醬中可培養(yǎng)細(xì)菌的含菌量，其中樣品HL1801含菌量最多，而樣品WC1601，GD1601含菌量最少(見(jiàn)表1)。此外，從每種蝦醬中都分離并純化得到了5株可培養(yǎng)細(xì)菌，菌落主要呈白色、乳白色、黃色、紅色，透明或不透明(見(jiàn)圖1)。這些結(jié)果都反映了不同地區(qū)蝦醬發(fā)酵工藝有別，加之發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短不同，最終造成了蝦醬中所含的細(xì)菌數(shù)量及形態(tài)存在差異。

表1 蝦醬的形態(tài)、可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及純化Table 1 The morphological characteristics, isolation and purification of culturable bacteria of shrimp paste

圖1 部分蝦醬的形態(tài)、可培養(yǎng)細(xì)菌的分離及純化Fig.1 The morphological characteristics, isolation and purification of culturable bacteria of shrimp paste

注：A為HL1801；B為HL1801的菌株分離；C為菌株HL1801B5的純化；D為DA1601；E為DA1601的菌株分離；F為菌株DA1601B4的純化。

2.2 分離菌株的遺傳多樣性分析

隨機(jī)選取18株分離菌株，提取基因組DNA，擴(kuò)增16S rDNA片段并測(cè)序。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，對(duì)測(cè)得菌株的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索同源序列，所得結(jié)果表明本研究中測(cè)得的序列均與Bacillus屬菌株序列相似度最高，挑取部分代表性菌株序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由鄰接樹(shù)可以看出，18株菌株在聚類上分成3個(gè)類群。分離自海南三亞蝦醬樣品的3株菌株SY1601B1，SY1601B4，SY1601B5與B.amyloliquefaciens，B.siamensis及B.methylotrophicus這3個(gè)種親緣關(guān)系較近，自展值為86(見(jiàn)圖2中A)。來(lái)自海南文昌和海南鶯歌海的蝦醬樣品，雖然在產(chǎn)地上位于海南島的東北部和西南部，相距較遠(yuǎn)，但從這2個(gè)樣品中分離到的菌株WC1601B2，YGH1601B4與B.megaterium，B.aryabhattai聚類，這反映了蝦醬中微生物的種類可能不僅與發(fā)酵所處的環(huán)境相關(guān)，發(fā)酵工藝也是影響其組成的重要因素。其他13株來(lái)自海南定安、廣東臺(tái)山、海南三亞、海南黃流、海南鶯歌海、海南文昌的菌株則與B.toyonensis，B.thuringiensis，B.anthracis及B.cereus聚為一類。事實(shí)上，這些菌株來(lái)自6個(gè)不同地區(qū)，在發(fā)酵過(guò)程中蝦醬接觸的環(huán)境差別較大，但分離到的菌株親緣關(guān)系較近，再次反映了相似的發(fā)酵工藝可能造成蝦醬中存在親緣關(guān)系較近的菌群。

根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的最大簡(jiǎn)約樹(shù)與鄰接樹(shù)結(jié)構(gòu)相似，18株菌株聚為3個(gè)不同的類群(見(jiàn)圖2中B)。Han等[9]研究表明蝦醬中存在豐富的微生物菌群，其中以Staphylococcusequorum，Halanaerobiumsaccharolyticum，Salimicrobiumluteum及Halomonasjeotgali為主要類群。Jung等[10]在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期蝦醬中優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門，然而很快就被Pseudoalteromonas，Staphylococcus，Salimicrobium和Alkalibacillus等厚壁菌門取代。然而本研究及系列相關(guān)工作中并未分離到這些菌株，這不僅體現(xiàn)了同一蝦醬產(chǎn)品中存在多種微生物菌群，也反映了不同來(lái)源的蝦醬，其微生物菌群差異顯著，可能是造成最終風(fēng)味差異的重要原因之一。

圖2 根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic trees based on 16S rDNA

注：1000次重復(fù)，自展值(Bootstrap)>60%；A為鄰接樹(shù)；B為最大簡(jiǎn)約樹(shù)，步長(zhǎng)=181；一致性指數(shù)(CI)=0.769；總留存指數(shù)(RI)=0.970。

3 結(jié)論

本研究對(duì)6種南海蝦醬中可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行分離，通過(guò)測(cè)定16S rDNA序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明蝦醬中可培養(yǎng)細(xì)菌分為3個(gè)不同的類群，反映了我國(guó)南海蝦醬中可培養(yǎng)細(xì)菌遺傳多樣性豐富。由于制作工藝差異、發(fā)酵環(huán)境差異造成參與發(fā)酵的微生物類群存在多樣性，最終導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不同。