劉愛東，王 箐 ，田 琳，劉曉紅，曾俊偉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

有研究表明，高糖環(huán)境下腎臟細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激(Oxidative stress,OS)損傷可能是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)病的重要機(jī)制之一[1-2]，高糖誘導(dǎo)的線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基(Reactive oxygen radicals,ROS)是糖尿病并發(fā)癥的始動(dòng)環(huán)節(jié)[3-4]。硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)具有較強(qiáng)的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等功能[5]。硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide,NaHS)是外源性H2S供體硫化鹽的一種，在溶液中可分離出Na+和HS-，隨后HS-和H+生成H2S。NaHS作為H2S供體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于H2S的研究當(dāng)中。本研究的目的在于通過(guò)培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，觀察NaHS在低糖條件和高糖誘導(dǎo)下對(duì)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購(gòu)于上海生命科學(xué)院；NaHS(純度72%)購(gòu)于Sigma公司；DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購(gòu)于Hyclone公司；青鏈雙抗購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；D-葡萄糖(純度≥99.5%)購(gòu)于阿拉丁試劑公司，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)于Sigma公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde;Malonic dialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-px)、過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide,H2O2)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE熒光探針)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo，型號(hào):Labserv CO-150)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰科技有限公司)；離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào):5418)；分光光度計(jì)(BIO-RAD公司)；恒溫水浴(Leica公司，型號(hào):HI1210)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司) 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的HK-2細(xì)胞，37 ℃快速解凍后，1 200 rpm離心5 min，用DMEM培養(yǎng)基清洗2次后用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸再離心；加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基；待細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合后接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 待同步化培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為8 組：①低糖對(duì)照組(5.5 mmol/L D-葡萄糖)；②低糖+NaHS低劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 50 μmol/L)；③低糖+NaHS中劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 100 μmol/L)；④低糖+NaHS高劑量組(5.5 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 200 μmol/L)；⑤高糖組(40 mmol/L D-葡萄糖)；⑥高糖+NaHS低劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 50 μmol/L)；⑦高糖+NaHS中劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 100 μmol/L)；⑧高糖+NaHS高劑量組(40 mmol/L D-葡萄糖+NaHS 200 μmol/L)；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理24、48 h后，分別收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SOD活性、MDA含量、GSH-px活力的測(cè)定 取各組于24、48 h收集的上清液，用比色法測(cè)各組培養(yǎng)液中的SOD活性、MDA含量和GSH-px活力。

1.2.3.1 檢測(cè)SOD活性 按照說(shuō)明書的具體步驟加樣混勻，室溫放置10 min，于波長(zhǎng)550 nm處，1 cm光徑比色皿，蒸餾水調(diào)零，比色。代入計(jì)算公式測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性(U/mL)。

1.2.3.2 檢測(cè)MDA含量 按照說(shuō)明書的具體操作步驟加樣后漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻，532 nm處，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管吸光值。依照計(jì)算公式測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA(nmol/mL)。

1.2.3.3 檢測(cè)GSH-px活力 第一步進(jìn)行酶促反應(yīng)，按照說(shuō)明書的具體操作步驟加樣后混勻，3 500 rpm離心10 min，取上清1 mL作顯色反應(yīng)。第二步顯色反應(yīng)，按照說(shuō)明書的具體操作步驟加樣后混勻，室溫靜置15 min后，波長(zhǎng)412 nm，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光值。代入公式計(jì)算GSH-px活力(nmol/mL)。

1.2.4 比色法測(cè)各組培養(yǎng)液中的H2O2水平 取各組于 24、48 h收集的上清液，按照說(shuō)明書的具體操作步驟加樣混勻，于405 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光值。帶入計(jì)算公式得出培養(yǎng)液中的各組培養(yǎng)液中H2O2水平(mmol/mL)。

1.2.5 激光共聚焦觀察各組ROS水平 待細(xì)胞長(zhǎng)滿后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞密度達(dá)80%。在各組加藥24、48 h后吸棄培養(yǎng)液，加入濃度為10 μmol/L的DHE熒光探針溶液，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min后，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DHE。用激光共聚焦顯微觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度并拍照。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液SOD活性、MDA含量以及GSH-px活力結(jié)果 高糖組24、48 h的SOD活性和GSH-px活力較低糖對(duì)照組下降(P<0.01，P<0.05)，而MDA含量增高(P<0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h，低糖+NaHS低、中、高劑量組SOD活性和GSH-px活力較低糖對(duì)照組增高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)；高糖+NaHS低、中、高劑量組SOD活性和GSH-px活力較高糖組增高(P<0.01，P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05，見表1)。

組別SOD活性(U/mL) 24 h 48 hMDA含量(nmol/mL)24 h 48 hGSH-px活力(nmol/mL)24 h 48 h 低糖對(duì)照13.555±0.47113.762±0.7888.215±0.06110.326±0.16025.550±0.70328.038±0.760低糖+NaHS低劑量14.560±0.144*14.771±0.3908.509±0.029*10.705±0.185#30.045±0.673*32.961±0.494#低糖+NaHS中劑量16.488±0.499*16.694±0.636#9.443±0.135*11.776±0.318#30.675±1.576*33.680±1.943#低糖+NaHS高劑量17.355±0.142*17.494±0.259#9.514±0.083*10.653±0.154#43.154±1.384*47.366±1.482#高糖對(duì)照 5.178±0.543** 5.633±1.081##17.164±0.173#21.087±0.304#15.324±0.959*16.808±0.922#高糖+NaHS低劑量11.424±0.227△△11.791±0.449▲▲15.652±0.128△19.331±0.272▲21.555±1.327△23.647±1.359▲高糖+NaHS中劑量14.143±0.650△△15.148±1.660▲▲11.996±0.075△19.923±0.358▲33.253±1.432△36.509±1.677▲高糖+NaHS高劑量12.985±0.221△△13.139±0.499▲▲13.029±0.121△16.089±0.277▲27.829±1.516△30.538±1.800▲

與24 h低糖對(duì)照組比較,*：P<0.05,**：P<0.01; 與48 h低糖對(duì)照組比較,#：P<0.05,##：P<0.01;與24 h高糖對(duì)照組比較,△：P<0.05,△△：P<0.01; 與48 h高糖對(duì)照組比較,▲：P<0.05,▲▲：P<0.01。

2.2 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液H2O2水平的結(jié)果 高糖組24、48 h的H2O2水平較低糖對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h，低糖+NaHS低、中、高劑量組H2O2水平與低糖對(duì)照組相比，以中劑量的NaHS對(duì)H2O2水平降低效果明顯(P<0.05)；高糖+NaHS低、中、高劑量組H2O2水平與高糖組相比，有不同程度的降低，其中以中劑量的NaHS對(duì)H2O2水平降低效果更為明顯 (P<0.05，見表2)。

組別H2O2水平(mmol/L) 24 h 48 h低糖對(duì)照125.005±4.035190.288±9.658低糖+NaHS低劑量130.533±4.462198.428±9.600低糖+NaHS中劑量 115.474±4.340*176.431±15.984#低糖+NaHS高劑量126.999±4.141 193.233±10.332高糖對(duì)照244.388±7.969**369.031±19.720##高糖+NaHS低劑量230.388±7.480 345.516±17.980高糖+NaHS中劑量 160.787±21.396△242.361±18.870▲高糖+NaHS高劑量199.845±6.287△300.587±15.490▲

與24 h低糖對(duì)照組比較,*：P<0.05,**：P<0.01; 與48 h低糖對(duì)照組比較,##：P<0.01;與24 h高糖對(duì)照組比較,△：P<0.05; 與48 h高糖對(duì)照組比較,▲：P<0.05。

2.3 測(cè)定各組ROS水平的結(jié)果 高糖對(duì)照組24、48 h的ROS水平較低糖對(duì)照組明顯增加。細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h，低糖+NaHS低、中、高劑量組ROS水平與低糖對(duì)照組相比，均有不同程度的降低，其中以中劑量的NaHS對(duì)ROS水平降低效果較明顯；高糖+NaHS低、中、高劑量組ROS水平與高糖對(duì)照組相比，也有不同程度的降低，其中以中劑量的NaHS對(duì)ROS水平降低效果較明顯 (見圖1～2)。

A:低糖對(duì)照組; B:低糖+NaHS低劑量組; C:低糖+NaHS中劑量組; D:低糖+NaHS高劑量組; E:高糖對(duì)照組; F:高糖+NaHS低劑量組; G:高糖+NaHS中劑量組; H:高糖+NaHS高劑量組。圖1 細(xì)胞培養(yǎng)24 h高糖及NaHS對(duì)各組HK-2細(xì)胞ROS水平影響

A:低糖對(duì)照組; B:低糖+NaHS低劑量組; C:低糖+NaHS中劑量組; D:低糖+NaHS高劑量組; E:高糖對(duì)照組; F:高糖+NaHS低劑量組; G:高糖+NaHS中劑量組; H:高糖+NaHS高劑量組。圖2 細(xì)胞培養(yǎng)48 h高糖及NaHS對(duì)各組HK-2細(xì)胞ROS水平影響

3 討論

DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭的主要原因。高血糖是公認(rèn)的DN中起關(guān)鍵作用的因子，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的損傷在早期糖尿病腎病的形成中具有重要作用[6]。高血糖環(huán)境下，可引起腎組織發(fā)生氧化應(yīng)激，損傷腎小管上皮細(xì)胞[7]。氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的ROS在DN發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵性作用[8]。在正常情況下，適量的 ROS在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平異常升高時(shí)，氧自由基的清除劑SOD不能及時(shí)將過(guò)量的ROS 清除，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜通透性的改變，進(jìn)而引起氧化損傷，并可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞發(fā)生紊亂，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9-10]。

SOD能清除超氧陰離子自由基(O2 -) ，其活力的高低直接反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力，GSH-px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的損害，反映機(jī)體的抗氧化能力。MDA 是過(guò)氧化脂質(zhì)分解產(chǎn)物，其含量測(cè)定常與 SOD 的測(cè)定相互配合，MDA 的濃度和SOD 活力可作為膜脂質(zhì)過(guò)氧化損害程度的主要標(biāo)志。高糖環(huán)境可引起內(nèi)源性H2S產(chǎn)生減少，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病理改變，補(bǔ)充外源性H2S或(和)內(nèi)源性H2S的增多有效抑制了DN的病理改變，抑制細(xì)胞凋亡[11～13]。H2O2作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子可進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，在生理狀況較低水平可模擬生長(zhǎng)因子的某些效應(yīng)，如增殖和(或)存活。但H2O2濃度的急劇增高可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA氧化及損傷，繼而發(fā)生細(xì)胞突變和凋亡[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖培養(yǎng)HK-2 細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 增多，培養(yǎng)液中H2O2水平增高，MDA含量逐漸增高，而 SOD 活性降低、GSH-px活力減退，說(shuō)明高糖誘發(fā)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，表明氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)生。給予不同濃度的NaHS，可減少高糖環(huán)境下ROS 生成，減少H2O2的產(chǎn)生，降低MDA 含量，提高SOD活性和GSH-px活力，對(duì)腎小管起一定的保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)研究中，還發(fā)現(xiàn)外源性H2S可減少低糖條件下ROS 生成，減少低糖條件下的H2O2的產(chǎn)生，降低MDA 含量，提高SOD 活性以及GSH-px活力。在以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示外源性H2S可抑制低糖和高糖條件下的HK-2細(xì)胞的凋亡[13]。

綜上所述，無(wú)論在低糖條件還是高糖環(huán)境，外源性H2S可通過(guò)減輕腎小管細(xì)胞的氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其對(duì)腎臟的保護(hù)作用。