薩如拉，彭曉亮，饒德英

（赤峰學院 生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

花生（拉丁名：Arachis hypogaea Linn），因為地上開花地下結(jié)果，因而得名落花生,薔薇科草本植物.原產(chǎn)地為南美洲大陸，因其產(chǎn)油量高，營養(yǎng)豐富，而被廣泛種植.目前全球種植花生的國家已經(jīng)達到100余個，其中亞洲花生產(chǎn)量最高，非洲次之[1].

花生在我國的種植歷史悠久，文獻顯示[1]，花生在中國的種植始于清朝.新中國成立以后，花生作為重要的油料作物，國家將重點扶持種植，目前我國的花生年產(chǎn)量高達1500萬噸.中國花生的種植主要在亞熱帶地區(qū)，主要集中在河北、山東、河南和安徽等地.花生具有重要的經(jīng)濟價值，主要體現(xiàn)在兩方面:一方面它是重要的油料作物，產(chǎn)油量遠高于同類作物，高達50%[2].另一方面，它具有重要的藥用價值.《本草求真》中記載服用花生可以治療乳汁缺少的癥狀[2].

花生在其進一步加工生產(chǎn)的過程中，將產(chǎn)生約其重量1/3的花生殼，通常這些花生殼被焚燒或作為廢物掩埋，只有少數(shù)用于飼料加工和工業(yè)用途，這不僅污染環(huán)境，而且也無法充分利用資源，無法最大限度地提高經(jīng)濟效益.花生殼中除了含有大量的碳水化合物外，還含有豐富的甾族化合物[2].其中的甾醇類物質(zhì)經(jīng)人工提純后可以作為抗氧化的保健品，在人體抗衰老和免疫過程中發(fā)揮著重要的作用.花生殼中還富含黃酮類物質(zhì)，這是一種多酚類物質(zhì)，具有潛在的藥用價值，在已有的文獻[2]中表明，黃酮類物質(zhì)有顯著降低膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）的功效，在治療高血脂及其心血管疾病方面也有較好的療效[3].目前，從花生殼中提取黃酮類物質(zhì)的方法較多，如采用乙醇萃取法、超聲破碎提取法、蛋白酶水解法等.本文使用萃取法為主體，使用乙醇作為萃取試劑，采用超聲波輔助的方法，對單一的萃取工藝進行改進，目的是提高花生殼中黃酮類物質(zhì)的提取率，并探索由工業(yè)大規(guī)模提取花生殼中的黃酮類物質(zhì)的途徑.

1 材料與試劑設(shè)備

1.1 材料與試劑

花生殼：花生購于赤峰市，去豆處理后，對花生殼機械粉碎，經(jīng)60目篩選后，備用.

試劑：無水乙醇（Ethanol absolute）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（Al(NO3)3）、氫氧化鈉(NaOH)、蘆丁標準品（20mg裝）.

1.2 儀器與設(shè)備

微波光波超聲波萃取儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、外可見分光光度計、低速離心機、粉碎攪拌機.

2 實驗方法

2.1 花生殼總黃酮超聲波輔助提取工藝流程

流程：去豆→粉碎→過篩→加提取劑→超聲波輔助提取→離心→定容→測定

2.2 蘆丁標準曲線的制作

蘆丁屬于常見黃酮物質(zhì)的一種，花生殼中的黃酮類物質(zhì)中蘆丁含量居首，且所有的黃酮類物質(zhì)都具有相似的結(jié)構(gòu)，因此可以用蘆丁代替總黃酮類物質(zhì)的含量[4].將20mg蘆丁標準品溶于70%乙醇中并使其達到體積的200mL,配置成濃度為100μg/mL的標準液（以下簡稱蘆丁標準液）.

用移液器依次準確吸取 0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL 蘆丁標準液置于 10mL帶有編號為1-7的具塞試管中，隨后，加入0.5mL質(zhì)量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉并放置5min.然后加10%硝酸鋁溶液0.5mL，渦旋振蕩5min；最后，加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，渦旋，用70%乙醇定容到10mL，渦旋.靜置15min后，吸取1號管中的溶液于玻璃比色皿中做空白調(diào)零，隨后，依次吸取2-7號管中溶液，用分光光度計測定510nm波長下溶液的吸光度.以溶液的吸光度為縱坐標，以蘆丁的濃度作為橫坐標繪制標準曲線[4].

2.3 單因素實驗

測定不同超聲時間，不同超聲功率，不同乙醇體積分數(shù)和不同料液比下花生殼中總黃酮的提取率.每種因素進行3次重復試驗并且取其平均值.

2.3.1 提取時間對花生殼中總黃酮提取率的影響

乙醇濃度70%、料液比1：50，提取溫度30℃，提取超聲功率300W，在此條件下研究不同的提取時 間 20min，30min，40min、50min、60min 和 70min對花生殼中總黃酮提取率的影響.

2.3.2 超聲功率對花生殼總黃酮提取率的影響

乙醇濃度70%、料液比1：50，提取溫度30℃，提取時間60min條件下研究不同的功率300W、350W、400W、450W、500W和550W對花生殼中總黃酮提取率的影響.

2.3.3 乙醇濃度（體積分數(shù)）對花生殼中總黃酮提取率的影響

料液比1:50，提取溫度30℃，超聲功率500W，提取時間60min條件下研究不同的乙醇體積分數(shù)50%、60%，70%，80%和90%對花生殼中總黃酮提取率的影響.

2.3.4 料液比對花生殼中總黃酮提取率的影響

乙醇濃度70%，超聲功率500W，提取溫度30℃，提取時間60min條件下研究不同料液比1：30、1：40、1：50、1：60、1：70 和 1：80 條件下對花生殼中總黃酮提取率的影響.

2.3.5 提取花生殼中總黃酮的正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，在每個單因素中，選取三個具有最高提取率的梯度進行正交試驗，并使用 L9（43）正交設(shè)計（見表 1）.

表1 正交試驗因素水平表

2.3.6 驗證試驗

單因素試驗的最佳組合與正交試驗最優(yōu)組合進行比較選取提取率高的一組作為最終的提取條件.

3 試驗結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線

表2 不同質(zhì)量濃度蘆丁的吸光值

圖1 蘆丁標準曲線

根據(jù)標準曲線得到的回歸方程為y=0.009x-0.0054，R2=0.9988

3.2 花生殼提取物中總黃酮含量的計算

吸取1.0mL花生殼提取液置于10mL試管中，按照蘆丁標準溶液測定法測定黃酮濃度.

花生殼總黃酮提取率（%）

其中C—提取液黃酮濃度（μg/mL）

V—提取液體積(mL)

n—提取液稀釋倍數(shù)

m—花生殼質(zhì)量（g）

3.3 單因素試驗

3.3.1 不同提取時間下對花生殼中總黃酮提取率的影響

表3 不同提取時間下花生殼中總黃酮的提取率

圖2 不同提取時間對花生殼中總黃酮提取率的影響

如圖2，在60min之前，黃酮的提取率隨著時間的延增加而增加，60min后，隨著提取時間的增加提取率基本保持不變，這是由于花生殼中的黃酮類物質(zhì)在60min左右基本完全提取，隨著時間增加提取率將基本保持平穩(wěn)[5].在60min左右黃酮提取率最高.所以選擇提取時間為60min作為花生殼中總黃酮適宜的提取時間.

3.3.2 不同超聲功率下對花生殼中總黃酮提取率的影響

表4 不同超聲功率下花生殼中總黃酮的提取率

圖3 超聲功率對花生殼中總黃酮提取率的影響

如圖3所示，在功率為400W之前，由于功率較低，花生殼細胞壁被破壞不完全，總黃酮提取率較低.隨著超聲功率的增加，黃酮類化合物的提取率逐漸增加.在超聲功率為400-450W之間變化不明顯，450-500W之間又呈現(xiàn)上升的趨勢，500W后，由于超聲功率過大引起黃酮類降解，再次開始下降[7].考慮到資源的節(jié)約以及超聲噪音的污染[8]，選擇提取花生殼中總黃酮超聲功率為500W為宜.

3.3.3 不同乙醇濃度（體積分數(shù)）對花生殼中總黃酮提取率的影響

表5 不同乙醇濃度下花生殼中總黃酮的提取率

圖4 乙醇濃度（體積分數(shù)）對花生殼中總黃酮提取率的影響

如圖4所示，在乙醇濃度超過70%、80%前，花生殼中總黃酮的提取率隨乙醇濃度的增加而增加，但由于花生殼內(nèi)黃酮類物質(zhì)有限，在提取率上升到一定程度時便保持平穩(wěn)，當乙醇濃度超過70%、80%后，由于除黃酮物質(zhì)外的其他成分溶出增多，影響后續(xù)的黃酮含量測定[9].因此，選取乙醇體積分數(shù)為70%作為花生殼中總黃酮的適宜提取濃度.

3.3.4 不同料液比對花生殼中總黃酮提取率的影響

表6 不同料液比對花生殼總黃酮的提取率

圖5 料液比對花生殼總黃酮提取率的影響

由圖5所示，在乙醇的料液比增加到（1：70）之前，總黃酮的提取率隨乙醇體積的增加而逐漸上升，這是由于提取劑越多總黃酮的溶出量越多，但是由于總黃酮的含量有限，在料液比為1:70之后，提取率呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，考慮到節(jié)約提取劑以及能源的消耗[10]，提取花生殼中總黃酮選用料液比為1:70較為恰當.

3.4 提取花生殼中總黃酮正交試驗結(jié)果

在黃酮類化合物提取單因素的試驗基礎(chǔ)上，對提取時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比四個因素進行正交試驗.以期待進一步獲得超聲波萃取花生殼中黃酮類化合物的工藝條件，結(jié)果見表2.從表2中的極差R可知，影響總黃酮提取率的因素的主次順序是：乙醇濃度＞超聲功率＞時間＞料液比，優(yōu)化后的提取工藝條件為A2B2C2D2，即提取時間為60min，料液比為1:70，提取功率為500W，乙醇濃度為80%，提取率為3.25%

表7 正交試驗結(jié)果與分析

3.5 驗證試驗結(jié)果

從花生殼中提取總黃酮的單因素試驗確定的最佳條件下進行花生殼中總黃酮的提取，即提取時間60min，料液比1:70，提取功率500W，乙醇濃度80%，提取率為3.25%.與花生殼中總黃酮提取正交試驗表中所有組合相比得到提取率最高的組合為A2B1C3D3，即提取時間為 60min，料液比為 1：60，提取功率為550W，乙醇濃度為90%，在此條件下黃酮的提取率能達到3.39%.高于其他任意一組優(yōu)化條件的提取率.因此通過該提取試驗獲得的最佳的提取優(yōu)化條件為提取時間60min，料液比1:60，提取功率550W，乙醇濃度90%.

4 結(jié)論

本研究中使用超聲波輔助方法，通過單因素試驗和正交試驗來確定在從花生殼中提取總黃酮的最佳條件.即提取時間為60min，料液比為1：60，提取功率550W，乙醇濃度90%.本研究的工藝得到了對單一萃取法的改進，例如，在李杰、肖連東等人的所著的《花生殼中總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化》中總黃酮的最終提取率僅為1.74%，本研究的超聲波輔助提取后的最終提取率達到了3.39%，得到了大概2倍的提取率.超聲波輔助法大大縮短了單一萃取法的提取時間，達到了高效節(jié)能的目的，并且乙醇可以回收，利用成本較低，沒有污染和浪費.在黃酮類化合物的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景.