陳俊豪 ，丁文嶺 ，方麗君 ，徐洲 ，羅春景

（1.揚(yáng)州市江都區(qū)水產(chǎn)管理站，江蘇 揚(yáng)州 225200；2.揚(yáng)州市江都區(qū)小紀(jì)鎮(zhèn)神潼塔岳水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，江蘇 揚(yáng)州 225241；3.揚(yáng)州市江都區(qū)丁溝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)推廣中心，江蘇 揚(yáng)州 225235）

隨著小龍蝦池塘養(yǎng)殖和稻蝦綜合種養(yǎng)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，小龍蝦白斑綜合征病害問題也日漸突出。其病原為一種環(huán)狀雙鏈DNA病毒，能感染對(duì)蝦、螯蝦等各種蝦類，該病毒病流行快、發(fā)病廣、致死率高，對(duì)小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于白斑綜合征病毒類病原侵染動(dòng)物體后在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖，一般常規(guī)藥物無法在不傷害宿主細(xì)胞的情況下將其消滅，故而該病毒性疾病目前尚無特效治療藥物。因此在小龍蝦親本繁殖、苗種放養(yǎng)及養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中對(duì)病原的早期診斷和及早處理帶毒動(dòng)物體，及時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，并在基層生產(chǎn)指導(dǎo)單位建立快速準(zhǔn)確靈敏的WSSV檢測(cè)方法，對(duì)科學(xué)養(yǎng)殖指導(dǎo)工作有著重要的意義，對(duì)實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)的幫助也是顯而易見的。PCR檢測(cè)方法是一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的核酸片段，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣本純度要求低、簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室以及傳染病病原的檢測(cè)。自20世紀(jì)末，對(duì)于WSSV的PCR檢測(cè)方法就已有了系統(tǒng)研究，可對(duì)于將WSSV的PCR檢測(cè)方法引入生產(chǎn)實(shí)踐中，為養(yǎng)殖戶進(jìn)行病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，這在揚(yáng)州地區(qū)尚屬首次。近年來小龍蝦白斑綜合征在我國(guó)湖北、江蘇、安徽等小龍蝦主要養(yǎng)殖區(qū)域危害嚴(yán)重，每年的5月至6月和9月至10月，水溫在20～28℃為流行高峰，一旦發(fā)病，病死率高達(dá)90%以上。筆者在2018年上半年走訪了江蘇省揚(yáng)州市江都區(qū)兩戶小龍蝦養(yǎng)殖戶，皆因苗種攜帶了WSSV，在2017年秋后和2018年春夏期間，存塘小龍蝦急劇減少，導(dǎo)致養(yǎng)殖池塘血本無歸。為探索小龍蝦苗種及親本攜帶WSSV情況，便于從源頭上開展苗種產(chǎn)地檢疫，筆者等人利用PCR法分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)小龍蝦存塘親本、苗種、異地進(jìn)購(gòu)的蝦苗及發(fā)病塘養(yǎng)殖的小龍蝦進(jìn)行采樣檢測(cè)，取得了較好的效果，現(xiàn)將有關(guān)方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品的選擇

檢測(cè)樣品來源于江蘇龍禾生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責(zé)任公司（地點(diǎn)位于揚(yáng)州市江都區(qū)吳橋鎮(zhèn)）2017年存塘小龍蝦親本、2008年存塘小龍蝦繁育的苗種、泗洪某小龍蝦繁育公司的苗種及江都區(qū)真武鎮(zhèn)、邵伯鎮(zhèn)兩養(yǎng)殖戶（以下分別簡(jiǎn)稱為樣品 A1、A2、B、C、D、E）。

1.2 樣品規(guī)格和采集時(shí)間

樣品A1為2017年存塘的小龍蝦親本，規(guī)格30g/只左右，采集時(shí)間為2018年4月9日；樣品B、C為2018年繁殖的小龍蝦苗，規(guī)格4～5 g/只，采集時(shí)間為4月13日；樣品D為2017年存塘發(fā)病的種蝦、A2為2017年存塘的小龍蝦親本，規(guī)格約30 g/只，采集時(shí)間為5月23日；樣品E為2018年從外地進(jìn)購(gòu)的小龍苗，規(guī)格約5 g/只，采集時(shí)間為2018年6月7日。2018年5月23日前后江蘇龍禾生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司養(yǎng)殖的小龍蝦陸續(xù)出現(xiàn)死亡，經(jīng)檢查為2017年存塘的小龍蝦親本，此時(shí)正是小龍蝦白斑綜合征發(fā)病高峰期，在采集樣品D時(shí)，同時(shí)也在該池塘采集了樣品A2，經(jīng)PCR分子檢測(cè)，結(jié)果為WSSV陰性。

1.3 樣品處理

取活蝦苗或者活大蝦的鰓部，放在95%酒精中（可在常溫下保存30 d）或-20℃保存。如果用樣品95%酒精保存，處理前必須讓酒精完全揮發(fā)。充分研磨至粉末狀，無明顯顆粒。

1.4 DNA抽提

取 2～25 mg組織研磨物，加入 180μL GL Buffer，加入20μL蛋白酶K，10μL RNase A 混勻，56℃溫浴2～3 h，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，12 000 r/min離心2 min離心除雜質(zhì)；加入200μL GB buffer，200μL無水乙醇，充分混勻，將溶液加入收集柱小管Spin Column中，12 000 r/min離心2 min，去離心液；加入 500 μL WA Buffer，10 000 r/min離心 1 min，去離心液；加入700μL WB Buffer，10 000 rpm離心1 min，去離心液。重復(fù)1次以上步驟。再10 000 rpm離心2 min，把小柱加入新的1.5 mL離心管中，加入50～200μL Elution Buffer到小柱中央，靜置5 min，65 ℃ 溫浴 5 min，12 000 r/min，2 min 離心洗脫，可重復(fù)洗脫1次。

1.5 PCR

短時(shí)離心，按PCR儀WSV程序擴(kuò)增DNA：94℃，4 min、94 ℃，1 min、55 ℃，1 min、72 ℃、2 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃，10 min。4℃保溫，擴(kuò)增1 447 bp片段。

1.6 瓊脂糖核酸電泳

倒平板：用TBE緩沖液配制1.5%的瓊脂糖（含0.5μg/mL核酸染料）凝膠，厚0.5 cm；將平板放入水平電泳槽，電泳緩沖液剛好淹沒膠面；加樣：6μL（用MIX混合液）樣品加入樣品孔；電泳：根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度，5 V/cm電泳約30 min停止；紫外光下觀察核酸帶，并記錄結(jié)果。

1.7 nested-PCR

當(dāng)PCR結(jié)果為陰性（即電泳無帶）時(shí)，PCR產(chǎn)物可直接當(dāng)模板使用。當(dāng)PCR為陽性時(shí)，PCR產(chǎn)物要根據(jù)DNA帶的強(qiáng)弱用水稀釋10～1 000倍后才能作為nested-PCR的模板；短時(shí)離心，按PCR儀WSV 程序擴(kuò)增 DNA：94 ℃，4 min、94 ℃，1 min、55℃，1 min、72 ℃、2 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。4℃保溫，擴(kuò)增941 bp片段。

1.8 瓊脂糖核酸電泳

倒平板：用TBE緩沖液配制1.5%的瓊脂糖（含0.5μg/mL核酸染料）凝膠，厚0.5 cm；將平板放入水平電泳槽，電泳緩沖液（TBE,含0.5μg/mL核酸染料）剛好淹沒膠面；加樣：6μL（用MIX混合液）樣品加入樣品孔；電泳：根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度，5 V/cm電泳約30 min停止；紫外光下觀察核酸帶，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

圖1為樣品A1檢測(cè)結(jié)果，采樣地點(diǎn)：江都區(qū)吳橋鎮(zhèn)。圖1中，7號(hào)孔為陽性對(duì)照，8號(hào)孔為陰性對(duì)照，1—6號(hào)孔未出現(xiàn)1 447 bp大小陽性條帶；15號(hào)孔為陽性對(duì)照，16號(hào)孔為陰性對(duì)照，9—14號(hào)孔未出現(xiàn)941 bp大小陽性條帶，樣品A1判斷為陰性。

圖1樣品A1檢測(cè)結(jié)果

圖2 為樣品B、C檢測(cè)結(jié)果，采樣地點(diǎn)：泗洪某小龍蝦繁育公司、江都區(qū)吳橋鎮(zhèn)。圖2中，7號(hào)孔為陽性對(duì)照，8號(hào)孔為陰性對(duì)照，1—6號(hào)孔未出現(xiàn)1 447 bp大小陽性條帶；15號(hào)孔為陽性對(duì)照，16號(hào)孔為陰性對(duì)照，9—14號(hào)孔未出現(xiàn)941 bp大小陽性條帶，樣品B、C均判斷為陰性。

圖2 樣品B、C檢測(cè)結(jié)果

圖3 樣品D、A2檢測(cè)結(jié)果

圖3 為樣品D、A2檢測(cè)結(jié)果，采樣地點(diǎn)：江都區(qū)真武鎮(zhèn)、江都區(qū)吳橋鎮(zhèn)。圖3中，7號(hào)孔為陽性對(duì)照，8號(hào)孔為陰性對(duì)照，1—3號(hào)孔出現(xiàn)1 447 bp大小陽性條帶，4—6號(hào)孔未出現(xiàn)1 447 bp大小陽性條帶；15號(hào)孔為陽性對(duì)照，16號(hào)孔為陰性對(duì)照，9—11號(hào)孔出現(xiàn)941 bp大小陽性條帶，12—14號(hào)孔未出現(xiàn)941 bp陽性條帶，樣品D判斷為陽性，樣品A2判斷為陰性。

圖4為樣品E檢測(cè)結(jié)果，采樣地點(diǎn)：江都區(qū)邵伯鎮(zhèn)。圖4中，5號(hào)孔為陽性對(duì)照，6號(hào)孔為陰性對(duì)照，2、3號(hào)孔出現(xiàn)1 447 bp大小陽性條帶，1、4號(hào)孔為空白對(duì)照；11號(hào)孔為陽性對(duì)照，12號(hào)孔為陰性對(duì)照，8、9號(hào)孔出現(xiàn) 941 bp大小陽性條帶，7、10號(hào)孔為空白對(duì)照，樣品E判斷為陽性。

圖4 樣品E檢測(cè)結(jié)果

上列電泳照片中所使用的條帶標(biāo)記物均為DL2000 Marker。

第1次PCR擴(kuò)增后，陽性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)1條1 447 bp的DNA條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有該核酸帶；

第2次PCR擴(kuò)增后，陽性對(duì)照會(huì)出現(xiàn)1條941 bp的DNA條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照沒有該核酸帶。

因此，樣品A1、A2、B、C為白斑綜合征病毒（WSSV）陰性，樣品D、E白斑綜合征病毒（WSSV）陽性。

3 討論

小龍蝦苗種要從專業(yè)苗種繁育基地選購(gòu)，要對(duì)當(dāng)?shù)匦↓埼r白斑綜合征進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，避免多渠道或從小龍蝦白斑綜合征疫區(qū)進(jìn)購(gòu)苗種。筆者調(diào)查到江都區(qū)真武鎮(zhèn)、邵伯鎮(zhèn)兩戶養(yǎng)殖戶放養(yǎng)的苗種，一戶是2017年8月從周邊不同渠道收購(gòu)放養(yǎng)，另一戶是2018年4月從湖北某地進(jìn)購(gòu)，發(fā)病后在短時(shí)間內(nèi)存塘量急驟減少，經(jīng)采樣檢測(cè)小龍蝦均為白斑綜合征病毒（WSSV）陽性。

小龍蝦白斑綜合征發(fā)病水溫一般為20～28℃，在每年4月底到6月之間暴發(fā)，而小龍蝦苗種放養(yǎng)時(shí)多在3—4月，即便苗種或親本自身攜帶WSSV，但在發(fā)病季節(jié)前，小龍蝦體表無明顯癥狀，也不發(fā)生死亡。因此，苗種放養(yǎng)前對(duì)存塘苗種、親本及異地進(jìn)購(gòu)的苗種進(jìn)行WSSV檢測(cè)尤為重要。筆者等人2018年在小龍蝦放養(yǎng)前，對(duì)存塘小龍蝦親本、苗種、異地進(jìn)購(gòu)的苗種進(jìn)行了采樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為WSSV陰性，在5月23日前后雖有小龍蝦陸續(xù)死亡，但通過潑灑消毒劑、內(nèi)服Vc、免疫多糖等，病情很快得到控制。而在樣品A2池塘小龍蝦發(fā)病死亡的小龍蝦中，多數(shù)為存塘小龍蝦親本，筆者認(rèn)為主要原因是存塘小龍蝦親本在蝦苗孵出后，體質(zhì)虛弱，蛻殼不遂或蛻殼后體質(zhì)難以恢復(fù)而造成死亡。