王 芳 張 雅 李 婕 王四旺

(西安思源學(xué)院1，西安 710032)

(第四軍醫(yī)大學(xué)2，西安 710032)

山楂(Hawthorn)，別名紅果、山楂果、山里紅，為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge var major N.E.Br或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實，味酸、甘，微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)［1］?！侗静菥V目》記載“山楂性酸甘、微溫”“長于化飲食、健脾胃、行結(jié)氣、消淤血”，為我國特有的果樹，已有3 000多年的栽培歷史［2］。山楂中含有黃酮、萜類、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分［3－4］，可以軟化血管、降低血清膽固醇、抗氧化、助消化、抗菌，對冠心病和高血壓等多種疾病有很好的療效［5－7］。

山楂籽約占山楂總重的1/3，經(jīng)初步研究，它所含的各種成分與果肉差不多，同樣具有顯著降低血清中的膽固醇，抗氧化等功能［8－9］。我國每年至少收購15億kg山楂，其中約5 000萬kg的核棄為廢物。如何對山楂核進(jìn)行綜合利用，變廢為寶，發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)效益，是我們現(xiàn)在的當(dāng)務(wù)之急。有研究表明，山楂籽出油率高(10%以上)，可以降低膽固醇和甘油三脂［10］。并且有很好的體內(nèi)抗氧化活性［11］。根據(jù)目前研究表明，氧化應(yīng)激是很多疾病的發(fā)病因素之一，抗氧化劑在許多疾病的預(yù)防方面有重要作用［12－13］。那么具有好的抗氧化性的山楂籽油是否能作為功能性植物油開發(fā)，這些需要我們進(jìn)一步研究。

劉洪民等［14］研究了用CO2超臨界萃取方法提取山楂籽油的條件，并初步研究了山楂籽油的化學(xué)成分，為山楂籽油的研究奠定了的基礎(chǔ)。目前工業(yè)榨油多選用傳統(tǒng)的壓榨法，前期用傳統(tǒng)壓榨法榨取了山楂籽油，并進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示，壓榨法制得的山楂籽油物理化學(xué)性質(zhì)基本與文獻(xiàn)［14］研究相同，重金屬含量符合國家食用油安全標(biāo)準(zhǔn)(GB 2716—2005)。為了進(jìn)一步闡明山楂籽油的構(gòu)效機(jī)制，本實驗研究了山楂籽油的化學(xué)成分、脂肪酸組成、并建立了可靠的方法測定油中主要抗氧化活性物質(zhì)角鯊烯，4種構(gòu)型的維生素E、總黃酮以及總多酚含量，所建立的方法簡單、可靠。并進(jìn)一步研究了山楂籽油的體外抗氧化活性，為山楂籽油作為功能性食用油的開發(fā)及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果實產(chǎn)自河南，取出山楂核后洗凈晾干，委托楊凌飄香食用油有限公司以壓榨法進(jìn)行提取。共制備3批，把3批樣品混勻，避光保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

角鯊烯、DPPH(1，1－二苯基－2－三硝基苯肼)(CASD913－2)、ABTS(2'－聯(lián)氨 －雙 －3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)(CAS 30931－67－0)、37 component FAMEs mixture(LOT XA10868V)、維生素E標(biāo)準(zhǔn)品α－生育酚(LOT LC14119V)、!－生育酚(LOT LC14601V)、γ－生育酚(LOT LC12728V)、δ－生育酚(LOT LC13568V)、維生素 C(CAS50－81－7)、福林酚試劑(CAS F－9252)、蘆丁(批號:100080－200707)、沒食子酸(批號:110831－201204)、正三十二烷(CAS 544－85－4):均為色譜純;甲醇(色譜純)、注射用水(制水機(jī):milli－Q Advantage)自制;其余試劑均為分析純。

1.2.2 主要儀器

ISQ 110953 GC－MSsystem;LC－15C液相色譜儀;紫外－可見光分光光度計UV 2600;DZKW－D－1電熱恒溫水浴鍋;PS－08超聲波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 化學(xué)成分

山楂籽油用正己烷(色譜級)稀釋50倍，加入無水硫酸鈉適量過夜。GC條件:DB－5MS column(30 m ×0.25 mm ×0.25μm):安捷倫科技有限公司(美國);恒定流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣1 μL，載氣為氦氣(99.9%);初始溫度:60℃，保持 3 min;以3℃/min升至300℃，保持5 min。分流比:100∶1;進(jìn)樣口、傳輸線、離子源溫度分別為300、300、280℃。MS條件:電子能量70 eV、EI離子源、發(fā)射電流200 μA、掃描范圍20～550 amu。

1.3.2 脂肪酸組成

山楂籽油根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(ISO 5509:2000)進(jìn)行樣品處理。GC條件:GSBP－INOWAX－MScolumn(30 m×0.25 mm ×0.25 μm):GS－TEK(美國);恒定流量:1.5 mL/min;進(jìn)樣1 μL，載氣為氦氣(99.9%);初始溫度:初始溫度:50℃;以5℃/min升至230℃，保持18 min。分流比:10∶1，進(jìn)樣口、傳輸線、離子源溫度分別為250、280、250℃。MS條件:電子能量70 eV、EI離子源、發(fā)射電流200μA、掃描范圍20～550 amu。37 component FAMEs mixture標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷(分析純)稀釋10倍，按照以上色譜條件進(jìn)行分析，通過標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST05庫)，確定并計算脂肪酸種類及含量。

1.3.3 角鯊烯含量

山楂籽油根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(ISO 18609:2000)進(jìn)行樣品處理。GC條件:DB－5MS column(30 m×0.25 mm×0.25μm):安捷倫科技有限公司(美國);恒定流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣1 μL，載氣為氦氣(99.9%);初始溫度:180℃;以15℃/min升至260℃;以3℃/min升至280℃，保持2 min;以10℃/min升至200℃，保持3 min。分流比:10∶1;進(jìn)樣口、傳輸線、離子源溫度分別為300、300、280℃。MS條件:電子能量70 eV、EI離子源、發(fā)射電流200μA、掃描范圍20～550 amu。內(nèi)標(biāo)正三十二烷用正己烷(分析純)稀釋為1 g/L。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷(分析純)分別稀釋為一定濃度，按照以上色譜條件進(jìn)行分析。

1.3.4 維生素E含量

山楂籽油根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 1598—2008)進(jìn)行樣品處理。色譜條件:GS－120－5 C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Unimicrotech)(上海通微分析技術(shù)有限公司);流動相為甲醇∶水(98∶2)，流速為1 mL/min，柱溫:30℃，檢測波長為294 nm，進(jìn)樣量10μL。維生素E標(biāo)準(zhǔn)品處理:取適量α－生育酚、!－生育酚、γ－生育酚、δ－生育酚用甲醇(色譜純)稀釋成一定濃度，按照以上色譜條件進(jìn)行分析。

1.3.5 總多酚、總黃酮含量

1.3.5.1 樣品制備

取山楂籽油2 g，根據(jù)文獻(xiàn)［15］進(jìn)行樣品的提取。

1.3.5.2 總多酚含量

按照文獻(xiàn)［16］方法進(jìn)行測定。檢測波長為765 nm。樣品的多酚含量用沒食子酸當(dāng)量表示(mg GAEs/100 g DW)。

1.3.5.3 總黃酮含量

按照文獻(xiàn)［17］方法進(jìn)行測定。檢測波長為510 nm。樣品的總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量表示(mg REs/100 g DW)。

1.3.6 抗氧化活性的測定

1.3.6.1 對 DPPH 清除能力

取1.3.5.1 項下樣品提取物 200 μL，加 3.8 mL DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min。利用紫外－可見分光光度計在波長517 nm處測定吸光度。按照公式1計算清除率。

1.3.6.2 對 ABTS 清除能力

分別配置7.00 mmol/L ABTS溶液及2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，兩溶液等比例混合，于冰箱中放置12～16 h，用無水乙醇稀釋至吸光度大約為1.0左右(734 nm)。取樣品提取物200μL，加3.8 mL ABTS混合溶液，避光反應(yīng)6 min。利用紫外－可見分光光度計在波長734 nm處測定吸光度。按照公式1計算清除率。

式中:A0為空白對照的吸光度;Ai為樣品對DPPH/ABTS作用后的吸光度;Aj為樣品本身的吸光度

1.4 統(tǒng)計方法

各組實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要化學(xué)成分

對山楂籽油按照1.3.2所述方法進(jìn)行了GCMS分析，經(jīng)NIST05數(shù)據(jù)庫檢索，共鑒別出28種成分，初步確認(rèn)了23種，占總峰面積的83.9%，總離子圖見圖1。各成分按照面積歸一法計算，結(jié)果見表1。

由表1可知，山楂籽油中的低沸點成分是醛類，它們一般賦予了食品類的香氣。在高沸點成分中，含量最高的是亞油酸、油酸及其脂類。除此之外，還含有很多具有生物活性的功能性成分，例如角鯊烯、維生素E、多羥基成分、植物甾醇、脂肪醇等。其中角鯊烯含量最高。角鯊烯的抗氧化能力已經(jīng)得到公認(rèn)［18］。除此之外，他還能降低血清膽固醇及甘油三酯［19］。維生素E有很好的抗氧化能力，而植物甾醇則有很好的預(yù)防心血管疾病的作用。由此可見，山楂籽油具有很高的藥用價值。

圖1 山楂籽油總離子流圖

2.2 脂肪酸組成

本實驗用37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，共確定山楂籽油中含有14種脂肪酸(圖2、表2)。其中不飽和脂肪酸(UFA)多于飽和脂肪酸(SFA)，而不飽和脂肪酸中，多不飽和脂肪酸(PUFA)多于單不飽和脂肪酸(MUFA)。主要脂肪酸為亞油酸、油酸和棕櫚酸，占總峰面積的91%。

表1 山楂籽油化學(xué)成分

每種植物油的脂肪酸組成都不一樣，好的脂肪酸組成代表著油具有高的價值。山楂籽油的SFA、MUFA、PUFA組成類似于大豆油、玉米油和葵花籽油［20］，但是UFA卻比它們多。UFA不能在人體內(nèi)合成，只能從外界攝取，而UFA可以降低血漿膽固醇，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生［21－22］，并且增加胰島素的敏感性［23］。因此，山楂籽油的脂肪酸組成更有利于人類的健康。

圖2 脂肪酸總離子流圖

表2 脂肪酸成分分析

2.3 山楂籽油中抗氧化成分含量及抗氧化活性的測定

2.3.1 角鯊烯含量

為了得到準(zhǔn)確的角鯊烯含量，本實驗按照1.3.3方法，對樣品做了一定的純化處理，使得本方法測定的角鯊烯及內(nèi)標(biāo)峰附近無干擾峰，測得的值更加準(zhǔn)確(圖3)。通過GC－MS測定，山楂籽油中含有角鯊烯(236.64 ±13.20)mg/kg(標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=677 153.900 6x－238 091 4.669 6(R2=0.999 8)，高于很多植物油，例如油茶籽油(155.77 mg/kg)、苦瓜籽油(129.5 mg/kg)、葵花籽油(80.56 mg/kg)［20］等。對其方法學(xué)進(jìn)行研究，精密度(RSD 0.71%)和重復(fù)性(RSD 1.32%)均符合國家藥典(2015版)規(guī)定，回收率(80%、100%、120%)分別為 91.51%、97.75%、99.23%，RSD 為 2.67%、1.99%、2.12%。樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定(RSD 2.41%)，最低檢測限為 5.86 ng/mL。所建立方法簡單、可靠，可用于各種植物油中角鯊烯的常規(guī)檢測方法。

圖3 角鯊烯總離子流圖

2.3.2 維生素E含量

根據(jù)方法1.3.4，本實驗利用HPLC法對山楂籽油中4種構(gòu)型的維生素E含量分別進(jìn)行了測定。由圖4和表3可知，山楂籽油中沒有β－生育酚，主要為γ－生育酚，它的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于很多植物油中含量［24］。雖然α－生育酚在維生素E中的活性最高，但是最近研究表明，γ－生育酚可以改善炎癥、細(xì)胞增殖［25］，降低大腸癌的風(fēng)險［26］。

表3 維生素E、總多酚、總黃酮含量以及抗氧化活性(n=3)

圖4 維生素E HPLC圖

通過方法學(xué)驗證，α－生育酚、γ－生育酚和δ－生育酚的精密度(RSD)分別為 1.06%，、1.09%、0.95%，重復(fù)性(RSD)分別為2.34%、1.99%、2.01%?；厥章?80%、100%、120%)分別為 101.50% ～103.03%(RSD 1.56% ～2.19%)，99.8% ～103.4%(RSD 1.06% ～1.13%)和97.89% ～102.32%(RSD2.37%～2.56%)。均符合國家藥典(2015版)規(guī)定。所建立的方法可以準(zhǔn)確地檢測出植物油中的4種構(gòu)型維生素E的含量。

2.3.3 總多酚、總黃酮含量及抗氧化活性的測定

植物多酚及黃酮可以清除自由基，具有抗氧化活性。本實驗利用紫外分光光度法，測定了山楂籽油中總多酚、總黃酮的含量。實驗結(jié)果見表3。本實驗所用方法經(jīng)過方法學(xué)驗證，精密度、重復(fù)性、回收率均均符合國家藥典(2015版)規(guī)定。

山楂籽油中含有豐富的角鯊烯、維生素E、多酚、黃酮類成分，他們都是天然的抗氧化劑，為了進(jìn)一步評價山楂籽油的抗氧化活性，我們分別用了DPPH和ABTS方法，由表3可知，山楂籽油對DPPH和ABTS的清除能力均達(dá)到90%以上，說明山楂籽油有很好的抗氧化性。這為下一步山楂籽油的藥效研究提供了借鑒。

3 結(jié)論

3.1 利用GC－MS法對山楂籽油主要化學(xué)成分進(jìn)行了研究，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 (NIST05庫)，初步確認(rèn)了23種主要成分，其中亞油酸、油酸及其脂類是含量最高的成分。除此之外，山楂籽油中還含很多具有抗氧化活性的成分，如角鯊烯(6.11%)、維生素E(1.84%)等。

3.2 利用37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，共確定山楂籽油中含有14種脂肪酸。其中不飽和脂肪酸(UFA)多于飽和脂肪酸(SFA)，亞油酸、油酸和棕櫚酸為主要脂肪酸，占總峰面積的91%。結(jié)果顯示山楂籽油的脂肪酸組成有利于我們的健康。

3.3 植物油中含有的具有生物活性的成分往往決定著油是否可以作為功能性食用油進(jìn)行開發(fā)。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)山楂籽油中含有多種生物活性物質(zhì)。我們應(yīng)用GC－MS法對角鯊烯的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示山楂籽油含有角鯊烯(236.64±13.20)mg/kg，高于很多功能性植物油。通過HPLC法分別測定了山楂籽油中4個構(gòu)型維生素E含量。結(jié)果表明，山楂籽油中不含有!－生育酚，而γ－生育酚含量最高［(51.92±2.53)mg/100 g］。本實驗按照文獻(xiàn)［15－16］，分別比較了兩種提取溶劑，確定用40%乙醇提取油中總多酚和總黃酮。利用紫外分法測定山楂籽油中總多酚、總黃酮含量分別為(424.59±11.25)、(103.33±5.86)mg REs/100 g DW。這些成分均是天然的抗氧化劑，具有很好的抗氧化活性。

3.4 氧化應(yīng)激是很多慢性疾病發(fā)病的原因之一，開發(fā)抗氧化的食品可以對多種疾病起到預(yù)防治療的作用。我們用DPPH和ABTS方法評價了山楂籽油的體外抗氧化性，研究發(fā)現(xiàn)山楂籽油對DPPH和ABTS的清除能力均達(dá)到90%以上，山楂籽油有很好的抗氧化性。由此看來，山楂籽油作為一種功能性食用油進(jìn)行開發(fā)，具有很大的前景。