路 璐 ， 祝 宇 ， 顏興瓊 ， 龔 蕾 ， 孫衛(wèi)星 ， 楊金朋 ， 曲偉杰

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 云南昆明650201)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，GBS)，又稱B群鏈球菌，它是一種具有高度傳染性的專性乳腺寄生菌。在我國，因無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎發(fā)病率高達(dá)20%～40%，在德國[1]和巴西[2]等地也可達(dá)到11%～60%?？梢姡瑹o乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，應(yīng)引起科研人員的高度重視。

近年來，國內(nèi)外的研究均表明，抗生素在臨床上的廣泛使用導(dǎo)致致病菌的耐藥性問題越來越嚴(yán)重，尤其是多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生給奶牛乳房炎的臨床治療帶來了很大困難。因此，及時(shí)準(zhǔn)確的掌握致病菌的耐藥情況是目前防治奶牛乳房炎的關(guān)鍵，這對(duì)于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、防治無乳鏈球菌性乳房炎有著極其重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)15株無乳鏈球菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并檢測其攜帶的主要耐藥基因，旨在了解本地區(qū)的無乳鏈球菌的耐藥情況，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采自昆明某地區(qū)的71份隱性乳房炎(經(jīng)蘭州乳房炎檢測法LMT檢測體細(xì)胞數(shù)>50萬/mL)病牛乳樣。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌 ATCC25923，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室凍存；GBS標(biāo)準(zhǔn)株，購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑 5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基；革蘭染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；鏈球菌屬生化編碼鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和Gold view核酸染料，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×RapidTaqMaster Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖，購自北京沃比森科技有限公司；DL-2 000 DNA Marker，購自TaKaRa(大連)公司。

1.4 主要儀器設(shè)備 所用儀器包括超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、氣浴恒溫振蕩器、微量移液器、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀等。

1.5 病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定

1.5.1 菌株的分離及生化鑒定 用無菌棉拭子輕輕蘸取采集的乳樣在5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并挑取疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。于血平板上挑取疑似菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察其菌體形態(tài)。挑取革蘭染色陽性的疑似鏈球菌的菌落接種血平板進(jìn)行純培養(yǎng)后進(jìn)行觸酶試驗(yàn)、CAMP檢測和生化鑒定。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定 參考GenBank公布的無乳鏈球菌菌16S rDNA和特異性cfb基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增法對(duì)疑似菌株進(jìn)行鑒定，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。PCR 陽性產(chǎn)物直接送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的紙片擴(kuò)散法Kirby-Bauer(K-B)，測定無乳鏈球菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。取細(xì)菌純培養(yǎng)菌液0.2 mL滴入LB瓊脂培養(yǎng)基中，用三角環(huán)均涂勻后用滅菌鑷子將藥敏紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿貼5片，輕壓使其與瓊脂表面完全接觸；將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，用尺子測量每個(gè)藥敏紙片的抑菌直徑，記錄重復(fù)3次，抑菌圈直徑為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(Nccls)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.7 青霉素及紅霉素耐藥基因的檢測 通過藥敏試驗(yàn)可知分離菌對(duì)青霉素及紅霉素高度耐藥，因此，通過GenBank和相關(guān)文獻(xiàn)資料[3-4]査閱無乳鏈球菌青霉素及紅霉素相關(guān)的耐藥基因序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用PCR法擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA，PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。各耐藥基因的引物信息見表1。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌的分離與鑒定

2.1.1 細(xì)菌的形態(tài)及染色特性 在5%血平板上可見到菌落呈灰白色、半透明、表面光滑、圓形隆起的小菌落，呈β溶血；挑取疑似單菌落涂片鏡檢，結(jié)果顯示為革蘭陽性菌，呈鏈狀排列；觸酶試驗(yàn)為陰性。將鏡檢形態(tài)均符合鏈球菌特性，且觸酶試驗(yàn)為陰性的細(xì)菌，判定為鏈球菌屬細(xì)菌。本試驗(yàn)從71份隱性乳房炎乳樣中分離到鏈球菌36株。

2.1.2 CAMP及生化試驗(yàn)結(jié)果 CAMP檢測可觀察到部分血平板上金黃色葡萄球菌和分離菌劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣的β溶血區(qū)，結(jié)果顯示呈陽性。

鏈球菌分離株的3次生化試驗(yàn)結(jié)果比較穩(wěn)定，其結(jié)果顯示，有部分分離株均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、蕈糖，馬尿酸鈉陽性，七葉苷、甘露醇、山梨醇呈陰性，水解精氨酸呈陽性，V-P試驗(yàn)陽性，PYR試驗(yàn)陰性。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》相對(duì)照，鑒定出無乳鏈球菌15株，所占比例為41.7%。

2.1.3 PCR鑒定結(jié)果 對(duì)臨床分離的36株疑似鏈球菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，有15株分離菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統(tǒng)可看到在1 500 bp處出現(xiàn)明亮的條帶；其特異性引物則在903 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，兩種引物均與預(yù)期條帶一致(圖1、2)。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST程序比對(duì)分析，結(jié)果顯示與無乳鏈球菌的同源性均在99%以上。該結(jié)果與上述生化鑒定結(jié)果一致。

圖1 15株無乳鏈球菌通用引物PCR產(chǎn)物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

圖2 15株無乳鏈球菌特異性引物PCR產(chǎn)物電泳圖

M：DL-2 000 Marker；W：陽性對(duì)照； 1-15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 分別對(duì)15株奶牛乳房炎源無乳鏈球菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。該試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)無乳鏈球菌對(duì)目前臨床上使用的大部分抗生素比較敏感，如對(duì)頭孢類抗生素、四環(huán)素類、喹諾酮類及慶大霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾敏中度或高度敏感，可供臨床參考；但也有部分菌株對(duì)一些藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，如對(duì)青霉素、紅霉素、林可霉素、克林霉素、萬古霉素、氨芐西林、新生霉素、磺胺異惡唑的耐藥率均較高，耐藥率依次分別為100%、93.3%、93.3%、93.3%、93.3%、80%、80%、53.3%，尤其是對(duì)青霉素嚴(yán)重耐藥，其耐藥率達(dá)到100%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

15株無乳鏈球菌分離株，表現(xiàn)出不同的耐藥類型，其中最少的是3耐(1株)，最多可達(dá)到15耐(1株)。大部分菌株表現(xiàn)出7種或8種耐藥表型，其中7耐有5株，占33.3%；8耐有4株，占26.7%。在分離的15株無乳鏈球菌中，共出現(xiàn)10種耐藥譜。該結(jié)果表明，奶牛場長期頻繁大量使用青霉素、紅霉素等藥物，并且不按照相關(guān)用藥規(guī)定使用，濫用抗生素，導(dǎo)致如此高的多重耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，這種現(xiàn)象應(yīng)引起高度的重視。15株無乳鏈球菌分離株的相關(guān)耐藥譜及耐藥類型見表3。

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果 采用PCR法對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因pbp1a、pbp2b、pbp2x，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、ermB、mefA進(jìn)行了檢測，并將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行了BLAST比對(duì)，試驗(yàn)結(jié)果顯示在β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢測中，15株無乳鏈球菌均檢出pbp1a和pbp2b基因，其檢出率均達(dá)到100%，但未檢出pbp2x；在大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因檢測中，ermB的檢出率達(dá)到100%，15株均含有ermB基因，ermA和mefA基因均未檢出。耐藥基因檢測結(jié)果見圖3、4、5。

表2 15株無乳鏈球菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S：敏感，I:中介R：耐藥

表3 15株無乳鏈球菌分離株耐藥類型和耐藥譜

圖3 15株無乳鏈球菌pbp1a基因的PCR檢測結(jié)果

M:DL-2 000 Marker；P:陽性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

圖4 15株無乳鏈球菌pbp2b基因的PCR檢測結(jié)果

圖5 15株無乳鏈球菌ermB基因的PCR檢測結(jié)果

M:DL-2 000 Marker；P:陽性對(duì)照； 1～15：PCR產(chǎn)物； 16：陰性對(duì)照

3 討論

無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，近年來，由于奶牛乳房炎的感染增多，臨床上常選擇性應(yīng)用青霉素等抗生素成為奶牛養(yǎng)殖場常用的防治措施之一[5-7]，加之抗菌藥的不合理使用，使得細(xì)菌的耐藥性增加，常用抗菌藥物(β-內(nèi)酰胺類)的殺菌作用大大減弱。本次試驗(yàn)通過對(duì)分離的15株無乳鏈球菌耐藥性檢測結(jié)果可知本地區(qū)無乳鏈球菌分離株對(duì)常用的青霉素類、紅霉素、林可胺類等抗生素存在不同程度的耐藥現(xiàn)象，尤其對(duì)青霉素完全耐藥，故臨床上不能繼續(xù)使用此類藥物來治療乳房炎，應(yīng)選擇敏感性高的藥物，如頭孢類、喹諾酮類等抗生素控制乳房炎。此外，該地區(qū)的多重耐藥現(xiàn)象也比較嚴(yán)重，其中以7耐和8耐居多，共9株，占60%，這很可能是本地區(qū)奶牛乳房炎的治療失敗原因之一。因此，在治療奶牛乳房炎時(shí)應(yīng)合理使用抗生素，定期進(jìn)行耐藥性檢測，及時(shí)調(diào)整藥物使用方案。

本試驗(yàn)通過對(duì)耐青霉素和紅霉素的分離菌進(jìn)行常見耐藥基因的檢測結(jié)果顯示，15株無乳鏈球菌均檢出攜帶ermB、pbp1a和pbp2b基因，說明在本地區(qū)導(dǎo)致無乳鏈球菌紅霉素耐藥的主要機(jī)制是ermB基因，而pbp1a和pbp2b基因是導(dǎo)致該菌青霉素耐藥的主要機(jī)制。本次試驗(yàn)結(jié)果分析可知，耐藥性菌株攜帶erm和pbp基因，其中所有分離菌均含有pbp1a和pbp2b兩種耐藥基因，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，均表現(xiàn)出青霉素耐藥，而大部分?jǐn)y帶ermB基因的菌株與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符，表現(xiàn)出紅霉素耐藥，但有1株菌攜帶ermB基因卻不對(duì)紅霉素耐藥，這很可能是由于該株菌基因不表達(dá)或其表達(dá)量較低引起的。由于青霉素和紅霉素均存在多種耐藥基因，且各地區(qū)基因的分布情況差異較大，為了完全弄清楚該地區(qū)奶牛乳房炎無乳鏈球菌耐藥基因分布情況，還需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行更廣泛更深入的探究。