王莉貞 ， 黃雅鑫 ， 黃采算 ， 李 錚 ， 李 崇 ， 賴重波 ， 梁祺英 ， 張 羽 ， 司紅彬

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 廣西南寧530005 ； 2.百色市右江區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局 ， 廣西百色533000)

倒扣草(Achyranthes aspera L.)為莧科植物粗毛牛膝的全草。主要分布廣東、廣西、云南、貴州、福建、湖南、山東、江蘇等地。倒扣草的種子、根、莖和葉中均有一定的藥用價(jià)值。倒扣草的藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在利小便，清血，消毒。治紅白痢疾，喉疾，跌打損傷，壯筋骨，散血，止痛，理腳氣[1]。

倒扣草的種子、根、莖和葉中含有很豐富的脫皮甾酮，其中以種子中含量最高。全草含倒扣草堿 (ahyranthine) 、β-蛻皮甾酮 (β-ecdysterone) 、甜菜堿 (betaine) , 種子中主要為倒扣草皂苷A、倒扣草皂苷B，根含皂苷, 其苷元均為齊墩果酸[2]。脫皮甾酮具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[3], 促進(jìn)傷口愈合[4], 降血脂, 降膽固醇, 抑制血糖上升的生物活性[5]。晉軍等研究發(fā)現(xiàn)，蛻皮甾酮可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用[6]。 齊墩果酸具有抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤等作用[7]；齊墩果酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、結(jié)核分枝桿菌、綠膿桿菌、志賀菌、鏈球菌均有一定的抑菌效果[8]。

大腸桿菌是臨床獸醫(yī)上常見的條件致病菌。近年來(lái)，多重耐藥大腸桿菌嚴(yán)重威脅到畜牧業(yè)的發(fā)展，同時(shí)耐超廣譜β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、氟喹諾酮類等多種抗生素的超級(jí)細(xì)菌頻繁報(bào)道。中藥與抗生素相比具有使細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)動(dòng)物機(jī)體的副作用小、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此，研發(fā)中藥制劑作為防控多重耐藥細(xì)菌性疾病成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)。

倒扣草可以治療小兒黃疸[9]、腰肌勞損[10]、與白花丹、蓖麻葉聯(lián)用母牛胎衣不下[11]。倒扣草水煮液用于抗菌試驗(yàn)較少報(bào)道，本試驗(yàn)擬用倒扣草水煮液與16種常用抗菌藥聯(lián)用，對(duì)3株含有多重耐藥基因的大腸桿菌做藥敏試驗(yàn)及聯(lián)合棋盤試驗(yàn)研究，對(duì)臨床獸醫(yī)預(yù)防多重耐藥大腸桿菌病起到指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 倒扣草全草，購(gòu)自廣西太華藥業(yè)有限公司。抗菌藥頭孢噻呋鈉(Ceftiofur Sodium)、阿米卡星(Amikacin)、阿莫西林(Amoxicillin)、磷霉素(Fosfomycin)、阿奇霉素(Zithromax)、利福平(Rifampin)、磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)等16種抗菌藥物用蒸餾水稀釋至終濃度為6 400 μg/mL，氟苯尼考為5 120 μg/mL。營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂等，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。3株多重耐藥大腸桿菌由廣西大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 菌株的分離與鑒定 從病死雞中分離培養(yǎng)大腸桿菌菌株，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。選擇疑似大腸桿菌菌株進(jìn)行16S RNA的PCR擴(kuò)增，并送生工(上海)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。參照GenBank已發(fā)表的CTX-M 基因序列，設(shè)計(jì)引物如下：16S RNA-F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；16S RNA-R：5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，預(yù)期片段為908 bp。

1.3 倒扣草水煮液的制備 取倒扣草全草100 g，按照料液比1∶10加入蒸餾水、浸泡過(guò)夜。第二天小火煮沸1 h,再按照1∶8、1∶6的比例加入蒸餾水，小火煮沸1 h，將3次的濾液收集合并，減壓抽濾2次，濃縮濾液至100 mL，此時(shí)倒扣草水煮液的濃度約為1 g/mL。

1.4 倒扣草與抗菌藥對(duì)產(chǎn)CTX-M 型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌的最小抑菌濃度(MICs)的測(cè)定 采用微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定倒扣草水煮液與16種抗菌藥對(duì)多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度(MICs)，操作過(guò)程按照CISI標(biāo)準(zhǔn)(2010版)。

1.5 倒扣草水煮液與抗菌藥對(duì)產(chǎn)CTX-M 型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌聯(lián)合的抑菌試驗(yàn) 按照96孔板縱、橫2個(gè)方向分別對(duì)倒扣草水煮液和抗菌藥進(jìn)行倍比稀釋。藥物相互作用效應(yīng)通過(guò)計(jì)算其最小部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration indices，F(xiàn)ICI)來(lái)判斷。 FICI判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)FICI≤0.5，為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)0.5

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 在普通瓊脂培養(yǎng)基上，大腸桿菌呈白色菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上，呈有光澤的玫紅色菌落；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)為有綠色金屬光澤的紫黑色菌落，在光學(xué)顯微鏡下呈短桿狀、粉紅色的革蘭陰性菌(見中插彩版圖1、2、3)。

2.2 大腸桿菌的耐藥基因型 在NCBI上使用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的片段與NCBI中大腸桿菌的16S RNA序列同源性達(dá)到90%以上，表明該菌株為大腸桿菌。

根據(jù)對(duì)大腸桿菌E1、E2、E3的藥敏值、結(jié)合聯(lián)合棋盤FICI值分析，選取耐藥基因超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因CTX-MU、氟苯尼考耐藥基因floR、磷霉素耐藥基因fosA3三種耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)， 72 ℃ 10 min；15 ℃ 60 min。在1%瓊脂糖凝膠上電泳。4種耐藥基因的引物序列見表1。結(jié)果顯示大腸桿菌E1含有CTX-MU；大腸桿菌E2含有CTX-MU，floR；大腸桿菌E3含有CTX-MU基因(如圖4)。

表1 耐藥基因引物信息

圖4 大腸桿菌E1、E2、E3的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：Marker 2 000；泳道1、4、7：CTX-M； 泳道2、5、8：fosA3； 3、6、9：泳道floR； 10、11、12分別為基因型CTX-M、fosA3、floR的陰性對(duì)照

2.3 三株大腸桿菌對(duì)抗菌藥及倒扣草水煮液的MICs及聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI) 見表2。

根據(jù)倒扣草水煮液聯(lián)合16種抗菌藥對(duì)大腸桿菌的MICs及聯(lián)合抑菌指數(shù)分析，可以得知：對(duì)于大腸桿菌E1，當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，倒扣草水煮液與任何西藥聯(lián)用時(shí)，均不表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)0.52時(shí)，倒扣草水煮液與左旋氧氟沙星、痢菌凈、林可霉素及氟苯尼考、阿奇霉素聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)為頡頏效應(yīng)。

對(duì)于大腸桿菌E2, 當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，倒扣草水煮液與氟苯尼考聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)0.52時(shí)，倒扣草水煮液與頭孢噻呋鈉、環(huán)丙沙星及阿奇霉素聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)為頡頏效應(yīng)。

對(duì)于大腸桿菌E3, 當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，倒扣草水煮液與磷霉素、利福平聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)0.52時(shí)，倒扣草水煮液與環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、阿米卡星聯(lián)用時(shí)，表現(xiàn)為頡頏效應(yīng)。

表2 倒扣草水煮液聯(lián)合16種抗菌藥對(duì)大腸桿菌E1、E2、E3的MICs及聯(lián)合抑菌指數(shù) (μg/mL)

黏桿菌素對(duì)大腸桿菌E1、E2，頭孢噻肟對(duì)大腸桿菌E3具有良好的敏感性，其最小抑菌濃度(MICs)均小于1.563。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2009版)，這3種抗菌藥的最小抑菌濃度(MICs)小于該抗菌藥對(duì)大腸桿菌的breakpionts。

3 討論

倒扣草對(duì)3株多重耐藥大腸桿菌菌株均有一定的抑菌效果。根據(jù)倒扣草水煮液聯(lián)合16種抗菌藥對(duì)大腸桿菌E1、E2、E3的MICs及聯(lián)合抑菌指數(shù)FICI的結(jié)果判定，以及3株大腸桿菌的耐藥基因型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)箍鄄菟笠号cβ-內(nèi)酰胺類抗菌藥聯(lián)用時(shí)對(duì)3株含CTX-MU耐藥基因的大腸桿菌基本表現(xiàn)為無(wú)關(guān)或拮抗效應(yīng)；倒扣草水煮液與利福平聯(lián)用時(shí)對(duì)3株大腸桿菌表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用；與氟苯尼考聯(lián)用時(shí)對(duì)含有floR基因型的大腸桿菌E2呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)、對(duì)不含floR基因型的大腸桿菌E1和E3呈現(xiàn)拮抗或相加效應(yīng)；倒扣草水提液與磷霉素聯(lián)用時(shí)，對(duì)大腸桿菌E3呈現(xiàn)協(xié)同作用；與磺胺間甲氧嘧啶鈉、阿米卡星等聯(lián)用時(shí)對(duì)3株大腸桿菌均呈現(xiàn)無(wú)關(guān)效應(yīng)。

氯霉素抗性基因floR導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)氯霉素產(chǎn)生抗藥性，主要是對(duì)氟苯尼考的抗藥性[12]。，當(dāng)?shù)箍鄄菟笠号c氟苯尼考聯(lián)用時(shí)對(duì)含有floR基因型的大腸桿菌E3呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。 Huang D等認(rèn)為齊墩果酸抗革蘭陰性菌的作用機(jī)理為它破壞了細(xì)菌的細(xì)胞外膜，引起形態(tài)改變導(dǎo)致細(xì)菌自溶，而吳蓓蓓等證實(shí)[13]floR基因編碼的蛋白位于細(xì)胞膜上。因此，認(rèn)為倒扣草中的齊墩果酸可能破壞革蘭陰性菌細(xì)胞膜上floR蛋白，從而與氟苯尼考聯(lián)用起到協(xié)同作用，對(duì)于不含floR蛋白的大腸桿菌，齊墩果酸沒(méi)有有效的作用靶點(diǎn)，細(xì)菌細(xì)胞膜不發(fā)生自溶，倒扣草水煮液與氟苯尼考聯(lián)用則起到拮抗作用。

FosA是一種Mn2+和K+依賴的谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)移酶，主要在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可破壞磷霉素的環(huán)氧基團(tuán)并催化谷胱甘肽(GSH)與磷霉素的1位碳原子形成化合物,引起磷霉素耐藥[15]。CTX-M型耐藥基因主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播的，在細(xì)菌的胞質(zhì)內(nèi)水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而起到耐藥作用[15]。fosA3和CTX-M基因編碼的蛋白均不在細(xì)菌的細(xì)胞膜上，齊墩果酸在細(xì)胞膜上找不到有效的作用靶點(diǎn)，故磷霉素、β-內(nèi)酰胺類抗生素與倒扣草水煮液聯(lián)用時(shí)基本為拮抗作用。

倒扣草水煮液與部分抗菌藥聯(lián)用可降低部分抗菌藥對(duì)多重耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度，從而減少或降低抗菌藥的使用量，延緩耐藥菌的產(chǎn)生。