劉 偉，鐘利橋，解華曉，吳路銀，姚 凡，倪朝輝

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部長江中上游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，武漢 430223；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

三苯基錫(triphenyltin，TPT)是一類重要的環(huán)境污染物，它具有較強的防腐、殺菌和殺藻能力，被作為船舶防污漆、木材防腐劑、PVC穩(wěn)定劑和農(nóng)作物殺菌劑等[1]廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)方面，其使用量呈現(xiàn)逐年遞增趨勢。全世界平均每年有300t左右含有大量有機錫防污涂料進(jìn)入到海洋環(huán)境中，對海洋環(huán)境造成巨大污染。例如，韓國沿岸的表層海水中TPT的濃度為5.9 ng/L(以錫計)[2]，青島石老人海水浴場的TPT濃度更是高達(dá)53.2 ng/L[3]。

水環(huán)境中TPT主要通過食物鏈的方式進(jìn)入生物體內(nèi)，對水生生物產(chǎn)生一定的毒性影響。目前，國內(nèi)外有許多關(guān)于三苯基錫化合物對水生生物的毒性效應(yīng)的研究。Santos等[4]報道指出TPT可導(dǎo)致疣荔枝螺(Thaisclavigera)的雄性個體雌性化，中國臺灣的福壽螺(Pomaceacanaliculata)也存在此現(xiàn)象[5]。同時，TPT對魚類也具有多種毒性效應(yīng)。Hu等[6]提出TPT可能通過改變肌肉組織結(jié)構(gòu)的方式影響魚體正常發(fā)育，甚至致畸，減緩或抑制魚體生長的猜想，來解釋我國野生中華鱘畸形和數(shù)量銳減的現(xiàn)象。宋志慧等[7]報道指出TPT可降低斑馬魚(Zebrafish)體內(nèi)的過氧化物酶活性。

除此之外，有關(guān)環(huán)境污染物對魚類生長及GH/IGF-I軸的毒性影響的研究也有很多。例如，F(xiàn)ruchtman等[8]使用久效磷處理斑馬魚發(fā)現(xiàn)，久效磷暴露至21 dph和30 dph時，GH表達(dá)量顯著性增加且GHR基因的表達(dá)受到抑制；暴露42 dph時，GH基因的表達(dá)水平降低。GH 還可促進(jìn)鯉、大麻哈魚和羅非魚等魚體的IGF-I基因的表達(dá)，而IGF-I以“負(fù)反饋”的形式調(diào)控GH的合成與分泌[9]。Haruhisa等[10]通過硬骨魚類體內(nèi)的IGF-I對GH調(diào)節(jié)的研究表明，IGF-I可降低虹鱒魚體內(nèi)及體外的GH分泌。

目前，有關(guān)TPT影響對魚類GH/IGF-I軸毒性影響的研究較少。因此，本研究以鯉為研究對象，以典型的TPT化合物三苯基氯化錫(TPTCl)為唯一目標(biāo)毒物進(jìn)行暴露實驗，從GH/IGF-I軸的角度探討TPT影響魚類生長的作用機理，為研究環(huán)境污染物對魚類生長影響的研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和試劑

實驗試劑：96% TPTCl(aladdin 公司)；ELISA 試劑盒(MSK公司)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas 公司；TRIZOL Reagent(Invitrogen)。

實驗儀器：電動研磨器(10D-79219,Janke & Kunkel-Str)；低溫冷凍離心機(centrifuge 5415R,Eppendorf 公司)、酶標(biāo)儀(SYNERGY/2,bioTek 公司)；ProFlex PCR儀及熒光定量PCR儀7500(均購自Applied Biosystems公司)；電泳儀(DYY-12,bioTek公司)。

1.2 實驗用魚

實驗用魚為鯉，購買自長江水產(chǎn)研究所荊州基地。嚴(yán)格按照鯉養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)操作(水溫(25±1)℃)，光照周期12 h∶12 h(光∶暗)，24 h連續(xù)通氣，養(yǎng)殖水中溶氧充足，每d投喂商業(yè)飼料兩次(8:00；14:00)，換水一次，馴養(yǎng)14 d后進(jìn)行正式實驗。

1.3 實驗設(shè)計

將實驗鯉平均放在12個養(yǎng)殖箱內(nèi)(每組3個重復(fù))，每個養(yǎng)殖箱放魚18條，實驗養(yǎng)殖水體積為100 L。依據(jù)預(yù)實驗所得TPT 96 h半致死濃度和環(huán)境濃度將實驗設(shè)定為0.024、0.24、2.4 μg/L三個TPT暴露組和一個對照組進(jìn)行暴露實驗。連續(xù)暴露7、21和48 d后分別取樣，取樣的前一天禁食。取樣時，隨機從每個實驗組取6尾魚，麻醉后抽血，低溫離心(4 ℃，3 000 r/min,30 min)制備血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血后，取鯉肝臟、腦垂體分別置于Trizol中用于基因表達(dá)檢測，均置于-80 ℃冰箱中備用；以上操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1.4 各項指標(biāo)測定及計算方法

1.4.1 血漿中GH和IGF-I 含量的測定

血漿中GH和IGF-I 含量檢測按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 肝臟GHR、IGF-I基因和腦垂體GH基因表達(dá)量的測定

鯉肝臟和腦垂體總RNA 的提取嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。然后熒光定量PCR儀進(jìn)行q-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(25 μL)為1μL 的cDNA、12.5 μL的 SYBR Green Mix、1 μL 的5μmol/L sense primer、1 μL 的5μmol/L anti-sense primer和9.5 μL 的ddH2O，95 ℃預(yù)變性2 min后進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 變性15 s,60 ℃退火15 s，60 ℃延伸 1 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s后進(jìn)行溶解曲線分析檢測擴增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt的方法測定各基因相對表達(dá)量。各檢測基因及β-actin的引物序列如表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers for q-PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

實驗用One-Way ANOVA方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(SPSS for Win 13.0 軟件)，差異顯著性以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為極顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TPT暴露對鯉血漿GH水平的影響

當(dāng)暴露至7 d時，與對照組相比，0.24 和2.4 μg/L 暴露組血漿中GH水平隨TPT暴露濃度的增加而升高且差異性極顯著，0.024 μg/L暴露組無顯著性變化；暴露至21和48 d時，0.24和2.4 μg/L暴露組GH含量較對照組顯著降低且差異性顯著，0.024 μg/L暴露組無顯著差異(圖1)。

圖1 三苯基錫暴露對鯉血漿GH水平的影響Fig.1 Effects of plasma GH concentration on C.Carpioafter TPT exposure 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)。*P<0.05，**P<0.01，圖2-5同。

2.2 TPT暴露對鯉垂體GH基因表達(dá)量的影響

TPT暴露至7 d時，鯉垂體GH mRNA水平較對照組無顯著性變化；暴露至21 d時，與對照組相比，2.4 μg/L暴露組垂體GH mRNA的表達(dá)被抑制且差異性極顯著，其他暴露組無顯著性變化；暴露至48 d時，0.024、0.24和2.4 μg/L暴露組垂體GH mRNA水平極顯著性降低且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(圖2)。

圖2 三苯基錫暴露對鯉垂體GH基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of the relative abundance on hepatic GH mRNA of C.Carpio after TPT exposure

2.3 TPT暴露對鯉血漿IGF-I 水平的影響

TPT暴露至7和21 d時，與對照組相比，0.24 μg/L暴露組鯉血漿IGF-I含量顯著性降低,2.4 μg/L暴露組下降極顯著，0.024 μg/L暴露組無顯著性變化；暴露至48 d時，0.24 μg/L暴露組下降極顯著(圖3)。

圖3 三苯基錫暴露對鯉血漿中IGF-I水平的影響Fig.3 Effects of plasma IGF-I concentration on C.Carpioafter TPT exposure

2.4 TPT暴露對鯉肝臟IGF-I基因表達(dá)量的影響

TPT暴露至7、21和48 d時,3個暴露組鯉肝臟IGF-I mRNA表達(dá)量隨濃度的增加和時間的延長而減少，0.24 和2.4 μg/L均較對照組存在極顯著差異；而0.024 μg/L暴露組僅在48 d時較對照組存在顯著差異(圖4)。

圖4 三苯基錫暴露對鯉肝臟IGF-I mRNA表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of the relative abundance of hepatic IGF-I mRNA on C.Carpio after TPT exposure

2.5 TPT暴露對鯉肝臟GHR基因表達(dá)量的影響

TPT暴露鯉至7 d時，鯉肝臟GHRmRNA水平較對照組無顯著差異。暴露至21 d時，與對照組相比，0.024 μg/L暴露組顯著性下降，0.24 和2.4 μg/L暴露組下降極顯著；暴露至48 d時，0.024 μg/L暴露組較對照組無顯著差異，0.24 和2.4 μg/L暴露組下降極顯著(圖5)。

3 討論

GH/IGF-I軸是硬骨魚類生長調(diào)控的主要軸線，它可通過影響魚體的生長、繁殖、代謝等方面調(diào)控魚體生長[11]。GH/IGF-I軸由GH、IGF-I、GH等多種調(diào)控因子組成，其中，GH和IGF-I又是GH/IGF-I軸參與魚類生長調(diào)控的主要調(diào)控因子[12]。正常情況下，魚類的生長與GH含量之間存在一種正相關(guān)關(guān)系[13]。但是在環(huán)境內(nèi)分泌物等外界不良因素的脅迫下，魚體血漿GH含量和垂體GH mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的趨勢。鄭燕[14]發(fā)現(xiàn)久效磷暴露羅非魚21 d時，血漿GH含量和垂體GH mRNA表達(dá)量均有顯著性增加，42 d時均顯著性低于對照組。Davis等[15]對羅非魚進(jìn)行七氯暴露發(fā)現(xiàn)，暴露至7 d時，血漿GH含量升高，14 d后GH含量隨暴露時間的增加而降低。本實驗血漿GH含量測定結(jié)果與上述報道的其他內(nèi)分泌物暴露對魚類血漿GH含量及垂體GH mRNA 表達(dá)水平的結(jié)果相似。這可能是由鯉魚肝臟中IGF-I因子對GH的合成和分泌的負(fù)反饋機制所導(dǎo)致。在暴露至21 d時，IGF-I對GH的負(fù)反饋作用促進(jìn)了GH的分泌；但是暴露至48 d時，由于暴露時間的延長，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)由于逐漸適應(yīng)了該種環(huán)境而減弱。

圖5 三苯基錫暴露對鯉肝臟GHR mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of the relative abundance of hepatic GHRmRNA on C.Carpio after TPT exposure

IGF-I是GH最主要也是最重要的調(diào)節(jié)基因，也是GH/IGF-I軸的核心因子[16]，它在機體的含量和魚體的生長具有一定的相關(guān)性。研究表明，血漿中IGF-I含量及肝臟中IGF-I mRNA的表達(dá)量與魚類的營養(yǎng)和生長狀況具有較強的正相關(guān)性[17]。Uchida等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著羅非魚IGF-I水平的下降，其體重和特定生長率降低。在對羅非魚、鮭、烏頰魚等硬骨魚類的的研究中也得出了相同的結(jié)論[19-21]。同時，肝臟IGF-I mRNA的表達(dá)還受到垂體GH的調(diào)控[16]。研究表明，GH可以促進(jìn)金魚、鯉、羅非魚等魚體中IGF-I mRNA的表達(dá)[22-24]，提高血漿中IGF-I含量[25]。此外，IGF-I還以“負(fù)反饋”的形式調(diào)控GH的合成與分泌[26]。Fruchtman等[27]研究顯示IGF-I能夠降低虹鱒垂體GH mRNA的表達(dá)。上述研究結(jié)果與本實驗結(jié)果一致，這表明TPT對肝臟中IGF-I mRNA的翻譯、分泌直至運輸?shù)窖獫{的途徑無顯著影響，而可能是通過影響IGF-I基因的轉(zhuǎn)錄來影響IGF-I的合成，從而抑制鯉生長。其中,IGF-I對GH的“負(fù)反饋”的反饋作用也更好的解釋了TPT暴露至7 d時，肝臟中IGF-I基因表達(dá)量和血漿中IGF-I水平顯著性下降，而垂體中GH基因表達(dá)量和血漿中GH卻顯著升高這一實驗結(jié)果。

GHR主要分布在肝臟，其他組織(如腎臟、鰓、腸等)也有分布但是含量很少[28]。GH主要是通過與細(xì)胞表面GH受體(GHR)結(jié)合，并促進(jìn)IGF-I 的合成與分泌，由IGF-I參與調(diào)控相關(guān)蛋白與脂質(zhì)的合成，進(jìn)而發(fā)揮促生長作用[29]。Fukada等[30]饑餓處理鮭后發(fā)現(xiàn)，GH和GH mRNA水平升高的同時GHRmRNA和IGF-I mRNA 水平下降，導(dǎo)致鮭生長減緩。本實驗中也得到類似結(jié)果，猜測可能是GHRmRNA 表達(dá)量的減少抑制了IGF-I的合成與分泌。

4 結(jié)論

(1)較高濃度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)長期暴露時，鯉垂體 GH分泌和GH mRNA的表達(dá)均受到抑制，尤其是當(dāng)TPT濃度為2.4 μg/L時，抑制效果極顯著。

(2)較高濃度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)短期暴露即可抑制IGF-I的分泌和IGF-I mRNA 的正常表達(dá)，并且隨暴露時間的延長和暴露濃度的增加抑制效果越顯著。

(3)短期TPT暴露對鯉GHRmRNA 的表達(dá)無顯著性抑制作用，當(dāng)長期暴露時，較高濃度的TPT(0.24 μg/L、2.4 μg/L)暴露均可抑制其正常表達(dá)。

以上結(jié)論顯示，血漿中GH及IGF-I和肝臟中GH 基因及IGF-I 基因均可以作為環(huán)境污染物對魚類生長影響的指示因子。