曹卓洋，呂清華，謝媛，方萍，*，汪榮才，葉達(dá)豐

（1.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，污染環(huán)境修復(fù)與生態(tài)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江省亞熱帶土壤與

植物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；3.寧波綠興農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江慈溪315300）

獺兔是一種典型的皮用兔，既可以提供珍貴裘皮，又可以提供優(yōu)質(zhì)兔肉。我國是世界獺兔養(yǎng)殖大國，獺兔皮、肉的產(chǎn)量和銷量居世界首位。由于幼兔免疫力較差，消化能力有限，很容易引起腹脹和腹瀉，甚至死亡[1]，所以，提高幼兔免疫力是降低其死亡率的重要途徑。冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼蟲被麥角科真菌中國被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生所形成的蟲菌復(fù)合體，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有10多種氨基酸、多種肽類及蟲草素、甘露醇、多糖等生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫力的功能[2]。由于冬蟲夏草菌寄生性苛刻，其寄主蝠蛾屬昆蟲的生境獨(dú)特，主要分布在我國青藏高原等海拔3 500～5 000 m的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)區(qū)，蝠蛾完成1個(gè)生命周期通常需要3～4年，所以冬蟲夏草天然資源十分稀少[3]。目前利用冬蟲夏草無性型即麥角科真菌中國被毛孢[4]或伴生菌蝙蝠蛾擬青霉（Paecilomyces hepiali）等通過深層液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體產(chǎn)品作為天然冬蟲夏草的人工替代品已廣泛用于保健食品中。鑒于此，能否利用液體發(fā)酵制備的冬蟲夏草菌絲體液作為獺兔飼料添加劑，以提高獺兔幼仔的免疫力，從而降低死亡率，值得探討。為此，本文對(duì)孕期及哺乳期母兔及其仔兔進(jìn)行日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的喂飼試驗(yàn)，通過測(cè)定斷奶幼仔的單窩存活率、整窩死亡率、免疫球蛋白數(shù)量、淋巴細(xì)胞陽性率、免疫器官指數(shù)等指標(biāo)，以考察冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液作為飼料添加劑對(duì)母兔產(chǎn)仔成活率以及對(duì)仔兔在斷奶應(yīng)激情況下免疫功能的影響，為家畜綠色飼料添加劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

冬蟲夏草菌種購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為ACCC50542。

基礎(chǔ)日糧配方：玉米13%、麩皮20%、豆粕15%、苜蓿草粉8%、麥芽根5%、草粉35%、復(fù)合預(yù)混料4%。改良日糧配方：在基礎(chǔ)日糧中添加2%冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose medium,PDA）：200 g土豆切成小塊，加1 000 mL水于鍋內(nèi)，加熱至沸騰，持續(xù)煮沸20～30 min，經(jīng)紗布過濾至1 000 mL燒杯中，加葡萄糖20 g，補(bǔ)充水分到1 000 mL，分裝于500 mL鹽水瓶，300 mL/瓶，在121.3℃下滅菌30 min，冷卻后備用。

PDA平板：在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂粉，同上滅菌后冷卻至45℃左右，倒入無菌培養(yǎng)皿，得PDA平板。

1.3 冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液制備

在無菌環(huán)境中，挑取冬蟲夏草菌斜面菌苔接種于PDA平板，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，挑取活化菌苔接種于PDA液體培養(yǎng)基，于20℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d，得冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液，備用。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

獺兔喂飼試驗(yàn)在寧波綠興農(nóng)業(yè)科技有限公司進(jìn)行。

1.4.1 孕期及哺乳期母兔喂飼試驗(yàn)

將80只體質(zhì)量相近且剛配種的同期懷孕母兔隨機(jī)分為2組，每組40只。對(duì)照組喂飼基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組喂飼改良日糧。試驗(yàn)從配種受孕開始至仔兔斷奶結(jié)束。期間記錄母兔產(chǎn)仔數(shù)、斷乳仔兔存活率，測(cè)定哺乳期母兔免疫球蛋白含量。

1.4.2 斷奶仔兔喂飼試驗(yàn)

從上述母兔喂飼的試驗(yàn)組所產(chǎn)仔兔中選取體質(zhì)量相近的斷奶仔兔10只，喂飼改良日糧（試驗(yàn)組Ⅰ）。從母兔喂飼試驗(yàn)的對(duì)照組所產(chǎn)仔兔中選取體質(zhì)量相近的斷奶仔兔20只，隨機(jī)分為2組：一組喂飼基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組），另一組喂飼改良日糧（試驗(yàn)組Ⅱ）。飼養(yǎng)35 d后，測(cè)定供試仔兔的免疫器官指數(shù)和T淋巴細(xì)胞陽性率。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目

1.5.1 存活率測(cè)定

記錄供試母兔產(chǎn)仔數(shù)、斷奶期仔兔存活數(shù)，計(jì)算斷奶期仔兔單窩存活率和整窩死亡率。

1.5.2 免疫球蛋白的測(cè)定

在母兔喂飼試驗(yàn)中，隨機(jī)取試驗(yàn)組和對(duì)照組哺乳期母兔各5只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，備用。采用間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）的含量。

1.5.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定

在仔兔喂飼試驗(yàn)中，隨機(jī)取試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和對(duì)照組仔兔各3只，禁食12 h，用采血器采血3 mL，保存于0℃下，備用。仔兔采血后頸動(dòng)脈放血致死，解剖，取蚓突、胸腺、脾、圓小囊4種免疫器官，剔去脂肪稱量，計(jì)算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)=器官質(zhì)量/mg÷活體質(zhì)量/g。

1.5.4 T淋巴細(xì)胞陽性率

采用α-醋酸萘酯酶（α-acidalpha naphthyl aetate esterase,ANAE）法[5-7]測(cè)定仔兔喂飼試驗(yàn)中試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和對(duì)照組血樣的T淋巴細(xì)胞陽性率，具體步驟如下：取血液推片，晾干，用福爾馬林-丙酮緩沖液（pH=6.6）在4℃條件下固定1.5 min，流水沖洗3 min，再用蒸餾水沖洗，空氣中干燥至少3 min；將血涂片浸入孵育液中，在37℃水浴箱內(nèi)孵育3 h，自來水沖洗3 min，再用蒸餾水略洗；用1%甲基綠溶液染色15 min，自來水洗去多余染液，在空氣中干燥。油鏡檢查200個(gè)淋巴細(xì)胞，胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色反應(yīng)產(chǎn)物者為ANAE陽性。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖；采用DPS 16.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔兔成活狀況比較

由表1可見：試驗(yàn)組和對(duì)照組各40只供試受孕母兔中分別有29只和24只產(chǎn)仔，平均單窩產(chǎn)仔數(shù)分別為4.7只與4.1只，經(jīng)t檢驗(yàn)表明，兩者并無明顯差異（P=0.22）；而試驗(yàn)組的斷奶仔兔單窩成活率顯著高于對(duì)照組28個(gè)百分點(diǎn)（P=0.02）。表2顯示，斷奶仔兔整窩成活率或部分成活率在試驗(yàn)組與對(duì)照組間均無顯著差異（P=0.34或0.29），而試驗(yàn)組斷奶仔兔的整窩死亡比率低于對(duì)照組33.5個(gè)百分點(diǎn)（P=0.02）。上述結(jié)果表明，母兔孕期與哺乳期喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧可明顯提高斷奶期仔兔的單窩成活率，顯著降低整窩死亡率。

2.2 哺乳期母兔免疫球蛋白含量比較

哺乳期母兔的IgA與IgG含量如表3所示。其中試驗(yàn)組的IgA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而IgG含量在兩組間未見顯著差異（P＞0.05）。

表1 不同處理單窩產(chǎn)仔數(shù)及斷奶仔兔成活率比較Table 1 Comparison of cub numbers and survival rate of weaning rabbits per mother rabbit between treatments

表2 不同處理斷奶仔兔整窩成活狀況比較Table 2 Comparison of weaning rabbit survival conditions of whole nest between treatments

表3 不同處理哺乳期母兔免疫球蛋白含量比較Table 3 Comparison of immune globulin content of mother rabbits in lactation between treatments

相同小寫字母表示在P＜0.05水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不同大寫字母表示在P＜0.01水平差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

The same lowercase letter indicates no significant difference at the 0.05 probability level;different uppercase letters indicate highly significant difference at the 0.01 probability level.

2.3 斷奶仔兔T淋巴細(xì)胞陽性率比較

仔兔喂飼試驗(yàn)中各組T淋巴細(xì)胞陽性率如圖1所示。試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ的T淋巴細(xì)胞陽性率均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而試驗(yàn)組Ⅰ顯著高于試驗(yàn)組Ⅱ。

2.4 斷奶仔兔免疫器官指數(shù)比較

由表4可知：試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ的蚓突指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而試驗(yàn)組Ⅰ與Ⅱ之間未見顯著差異；從數(shù)據(jù)上看，除胸腺指數(shù)外，試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ各項(xiàng)器官指數(shù)均高于對(duì)照組，但差異未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。

圖1 仔兔喂飼試驗(yàn)中不同處理的T淋巴細(xì)胞陽性率比較Fig.1 Comparison of positive T lymphocyte rate of young rabbits in different treatments

3 討論

從初生到斷奶階段的小兔稱為仔兔，從斷奶至75日齡的小兔稱為幼兔。這2個(gè)階段的兔因其生命力和消化機(jī)能較弱，抗病力差，容易發(fā)生消化系統(tǒng)疾病，如果飼養(yǎng)不善，則死亡率較高，有的高達(dá)60%～70%[8]。喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧后，懷孕母體產(chǎn)仔數(shù)有所提高，仔兔的存活率顯著高于對(duì)照組，這在一定程度上反映了仔兔抗病能力的增強(qiáng)。其可能原因是冬蟲夏草菌絲體含有蟲草素等增強(qiáng)免疫以及抗病能力的有效成分，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表4 冬蟲夏草對(duì)仔兔免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effects of Cordyceps sinensis on the immune organ index of young rabbits

脾、胸腺、蚓突、圓小囊是兔的重要免疫器官。一般認(rèn)為，免疫器官質(zhì)量增加是免疫增強(qiáng)的表現(xiàn)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在仔兔日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液可以顯著提高仔兔蚓突指數(shù)，并且喂飼改良日糧的仔兔器官發(fā)育更快更大，說明冬蟲夏草菌絲體可以促進(jìn)仔兔免疫器官綜合發(fā)育，促進(jìn)機(jī)體免疫機(jī)能成熟，這也許是該添加劑提高仔兔免疫能力的途徑之一。

本文采用α-醋酸萘酯酶（ANAE）反應(yīng)試驗(yàn)測(cè)定了T淋巴細(xì)胞中的酯酶，結(jié)果表明，試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。而ANAE陽性淋巴細(xì)胞率反映了成熟T淋巴細(xì)胞的含量，代表了機(jī)體細(xì)胞免疫水平。說明冬蟲夏草的有效成分可能通過促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟來提高免疫水平，其機(jī)制尚不明確。

免疫球蛋白是動(dòng)物受到抗原刺激后，體內(nèi)產(chǎn)生的一類能與抗原特異性相互作用的球蛋白。IgG和IgA是仔兔體內(nèi)2種重要的免疫球蛋白。其中：IgG是生物體液內(nèi)主要的免疫球蛋白，是機(jī)體抗感染免疫的主力抗體[11-12]；IgA在血清中的含量?jī)H次于IgG，占血清免疫球蛋白總量的10%～20%，在抵抗病原入侵方面極其重要[13]。本研究中，在懷孕母兔的日糧中添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液能顯著提高IgA的含量，這也可能是該添加劑通過增強(qiáng)體液免疫功能來提高懷孕母兔的免疫水平。

綜上所述，對(duì)孕期及哺乳期母兔喂飼添加冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液的改良日糧，有利于降低仔兔死亡率、提高母兔IgA含量，對(duì)斷乳幼兔喂飼改良日糧有利于提高免疫器官質(zhì)量和T淋巴細(xì)胞陽性率。由此可見，冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液作為飼料添加劑是一種很好的免疫增強(qiáng)劑，能在一定程度上促進(jìn)仔兔的免疫器官發(fā)育，提高仔兔免疫水平。而且冬蟲夏草菌絲體發(fā)酵液純天然，無耐藥性、無毒副作用，是一款綠色、環(huán)保、無害、高效的免疫增強(qiáng)劑，在一定程度上可以減少抗生素的濫用，對(duì)我國實(shí)施健康綠色生態(tài)養(yǎng)殖具有積極的意義。

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