張麗，劉麗霞，戴洪偉，陳紅，王瑞，岳炳輝2

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州730030；2.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院，青海湟源812100）

肌肉生長抑制素基因（myostatin,MSTN）屬于轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族成員之一，不僅對肌肉生長有負調控作用，還對脂肪的沉積和骨骼的生長發(fā)育具有調控作用，甚至還能影響肌腱和韌帶的強硬度。研究表明，該基因的突變與缺失可使家畜表現出肌肉超級發(fā)達的“雙肌性狀”[1]。比利時藍牛和皮爾蒙特牛的“雙肌”現象就是由MSTN基因第1外顯子和第3外顯子上的2個堿基突變造成蛋白活性區(qū)的移碼突變，從而不能形成成熟的MSTN蛋白，導致體質量增加而脂肪質量不增加[2]。敲除MSTN基因的小鼠除肌肉質量增加外，脂肪含量也隨年齡的增長而顯著降低[3]。

靜寧雞又叫靜原雞、固原雞，是適應黃土高原寒冷干旱生態(tài)條件的優(yōu)良肉蛋兼用型的地方雞種，因主產于甘肅省靜寧縣而得名。靜寧雞適應性強，體質結實，體形較大，覓食能力強，蛋質量較大，肉質好，具有獨特的地方風味，深受廣大人民的喜愛。但隨著近年來主產區(qū)人口外遷和引進品種的沖擊，靜寧雞飼養(yǎng)量日益下降，分布范圍逐步縮小，加之較嚴重的近親繁殖，其特色基因丟失，種質資源異化，優(yōu)良的靜寧雞已處于瀕危狀態(tài)，也使其分子方面的研究受到極大限制。目前僅見安鋒利[4]和李顯耀等[5]關于靜寧雞分子遺傳方面的研究，而有關靜寧雞MSTN基因多態(tài)性和蛋白結構的研究還未見報道。因此，如果能在靜寧雞群體中篩選出MSTN基因突變個體，則可通過育種培育出產肉率較高的優(yōu)良家禽品種，拯救靜寧雞遺傳資源瀕危問題。

為深入探討靜寧雞MSTN基因編碼蛋白的性質和功能，避免人工選育和基因演化造成的差異，本研究利用生物信息學方法對靜寧雞MSTN基因序列結構及相關生物信息學特征進行預測和分析，為揭示其理化性質、功能信息、遺傳特性、相關生理機制及與生長發(fā)育和肉質性狀的關系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 血樣采集與DNA提取

于寧夏彭陽縣靜原雞繁育中心采集第5世代靜寧雞血樣152份，用醫(yī)用采血管保存。采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法提取樣品的基因組DNA，用去離子水溶解稀釋。取DNA母液各5μL構建DNA混合池，于－20℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.2 引物設計

參考Ensembl中原雞MSTN基因序列（ENS GALG00000023961），利用Primer 5.0和Primer Select軟件設計3對特異性引物序列（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 聚合酶鏈式反應擴增和測序

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增體系（40μL）為：DNA模板2.0μL，0.25μmol/L 上 下 游 引 物 各 1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix 22.0μL，雙蒸水14μL。PCR擴增程序為：95℃預變性4 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4℃保存。然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。PCR產物經凝膠回收試劑盒純化回收后直接送至北京華大基因有限公司進行測序，測序結果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件進行比對和拼接，獲得靜寧雞MSTN基因編碼區(qū)序列。

表1 靜寧雞MSTN基因引物信息Table 1 Primer information of MSTN gene in Jingning chicken

1.4 等位基因頻率的估算

利用Bioedit軟件查看測序結果，運用MWSnap軟件測量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點等位基因峰高，并依據公式對各等位基因頻率進行估算[6]。其中，Fi表示SNP位點某等位基因頻率，h1和h2分別表示測序圖上該SNP位點等位基因1和2的峰高。

1.5 生物信息學分析工具

按照文獻[7-8]中介紹的在線軟件對靜寧雞MSTN基因編碼區(qū)進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 靜寧雞MSTN基因PCR分段擴增結果

靜寧雞MSTN基因PCR分段擴增檢測結果如圖1所示。從中可知，擴增產物電泳條帶清晰，特異性良好，片段大小與預期擴增片段長度相符。

2.2 靜寧雞MSTN基因序列測定

將拼接的靜寧雞MSTN基因與Ensembl中公布的原雞MSTN基因CDS區(qū)序列進行比對，共發(fā)現4個SNPs（圖2），其中在第1外顯子發(fā)現3個SNPs，分別為c.60G＞A、c.195C＞G、c.234G＞A，第3外顯子僅存在一個c.966G＞T突變。由于突變位點核苷酸的密碼子簡并現象，未引起編碼氨基酸的改變，均屬同義突變。

圖1 靜寧雞MSTN基因PCR擴增產物檢測結果Fig.1 PCR amplified products of MSTN gene in Jingning chicken

2.3 SNPs位點等位基因頻率估算

由表2可知，靜寧雞MSTN基因突變位點的等位基因頻率在突變前后存在差異，其中c.195C＞G和c.966G＞T突變前后差異較大，其余2個位點突變前后等位基因頻率差異較小。

2.4 生物信息學分析

2.4.1 靜寧雞MSTN蛋白理化性質分析

圖2 靜寧雞MSTN基因測序結果Fig.2 Results of MSTN gene sequencing in Jingning chicken

獲得的靜寧雞MSTN基因編碼區(qū)全長1 128 bp，含一個完整的開放閱讀框（open reading frame,ORF），包含起始密碼子和終止密碼子，編碼375個氨基酸。從圖3中可以看出：亮氨酸（Leu）數目最多（30個），占整個氨基酸組成的8.0%；組氨酸（His）數目最少（5個），占整個氨基酸組成的1.3%。正電荷殘基總數（Arg+Lys）和負電荷殘基總數（Asp+Glu）均為46個。帶正電荷氨基酸51個，酸性氨基酸81個，堿性氨基酸46個，極性氨基酸224個，疏水性氨基酸105個。對蛋白質空間結構起關鍵作用的半胱氨酸（Cys）為13個；α-螺旋終止者脯氨酸（Pro）為25個。蛋白質分子式為C1905H2988N510O561S22，分子質量約為42.7 kDa，理論等電點（pI）約為6.93，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數為44.19。

2.4.2 靜寧雞MSTN蛋白親水/疏水性預測

靜寧雞MSTN蛋白親水性/疏水性預測如圖4所示。第173位的異亮氨酸（Ile）疏水性最強（2.200），第263位的精氨酸（Arg）親水性最強（－3.056）。在整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占63.47%，疏水氨基酸占36.53%，總平均親水性為－0.399，總體表現為親水性。由此可知，靜寧雞MSTN蛋白是一種親水性蛋白[9]。

圖3 靜寧雞MSTN基因編碼蛋白氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of MSTN gene-encoded protein in Jingning chicken

2.4.3 SNPs對靜寧雞MSTN基因mRNA二級結構的影響

對外顯子1和3處的突變位點c.60G＞A、c.195C＞G、c.234G＞A、c.966G＞T進行mRNA二級結構預測分析的結果表明，SNPs突變前后引起mRNA二級結構改變，并導致mRNA二級結構的最小自由能發(fā)生改變（圖5）。其中：c.60G＞A位點突變前后的自由能未發(fā)生變化；c.195C＞G位點突變前后的自由能由－371.30 kJ/mol變?yōu)椋?74.23 kJ/mol；c.234G＞A位點突變前后的自由能由－363.34 kJ/mol變?yōu)椋?67.95 kJ/mol；c.966G＞T位點突變前后的自由能由－409.81 kJ/mol變?yōu)椋?98.93 kJ/mol。

2.4.4 靜寧雞MSTN蛋白的二級與三級結構預測

蛋白質二級結構主要指多肽鏈主鏈骨架依賴氫鍵排列成在一維方向上具有周期性結構的構象。使用SOPMA軟件預測靜寧雞MSTN蛋白二級結構的結果表明：169個氨基酸構成無規(guī)則卷曲，占總氨基酸的45.07%，99個氨基酸構成延伸鏈，占總氨基酸的26.40%；另外81個氨基酸和26個氨基酸分別形成α-螺旋和β-轉角，分別占總氨基酸的21.60%和6.93%。采用SWISS-MODEL對靜寧雞MSTN蛋白同源建模獲得三級結構模型（圖6），結果表明，靜寧雞MSTN蛋白主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈構成，這與二級結構預測結果一致。

圖4 靜寧雞MSTN基因編碼蛋白質的親水疏水性預測結果Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic predictions of MSTN geneencoded protein in Jingning chicken

3 討論

圖5 靜寧雞MSTN基因mRNA二級結構Fig.5 Secondary structure of mRNAof MSTN gene in Jingning chicken

圖6 靜寧雞MSTN蛋白三級結構預測Fig.6 Putative tertiary structure of MSTN protein in Jingning chicken

大量研究顯示，MSTN基因突變已導致人[10]、牛[11]、羊[12]、豬[13]和狗[14]表現出“雙肌性狀”。MSTN基因突變的純合體及雜合體與肉牛骨骼肌生長發(fā)育有關，使肉牛表現出肌肉超級發(fā)達、初生質量增加和生長速度快的優(yōu)勢[11]。在惠比特犬中存在1個可引起雙肌表型自然發(fā)生的突變c.939-940delTG，其編碼區(qū)第939～940 bp處缺失2個堿基T和G，從而引起第313位半胱氨酸轉變?yōu)榻K止密碼子；該純合突變具有雙肌表型，主要表現在寬闊的胸膛和發(fā)育超強的腿及頸部肌肉；雜合子的肌肉質量比野生型稍大，但表現出優(yōu)異的競速優(yōu)勢[14]。在綿羊中也發(fā)現了3個自然發(fā)生的突變可引起雙肌效應，其中c.960delG是編碼區(qū)第960位堿基G缺失，造成蛋白質翻譯移碼和終止子的提前生成，致使挪威白綿羊出現明顯的雙肌臀，且內臟脂肪和皮下脂肪含量偏低；c.120insA是編碼區(qū)第120位插入了堿基A，造成古挪威綿羊蛋白質翻譯移碼和終止子的提前生成；c.2360G＞A是MSTN基因3’UTR區(qū)發(fā)生的突變，雖沒有改變MSTN蛋白的功能，但能引起骨骼肌MSTN蛋白的高度表達，并引起MSTN的轉錄抑制效應，造成血液中MSTN蛋白含量大幅下降，同時表現出雙肌性狀，這一突變常見于夏洛來羊、白薩福克羊和無角道賽特羊等[15-17]中。MSTN基因也可能是影響家禽骨骼肌生長的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖，能夠作為候選基因用于提高地方雞產肉率的分子標記輔助選擇。通過抑制MSTN活性來增加肌肉量，在畜禽分子育種上具有潛在的應用價值。

MSTN基因在脊椎動物間高度保守。MCPHGRRON等[18]研究表明，人、雞、鼠、貓的MSTN蛋白在C-端同源性高達100%，而在牛、羊中只有1～3個氨基酸表現為不同，石斑魚MSTN的保守性較差，與其他動物羧基端同源性為88%。MSTN基因含有3個外顯子和2個內含子，不同物種間的MSTN基因長度有所不同。本研究獲得的靜寧雞MSTN基因編碼區(qū)全長1 128 bp，編碼375個氨基酸，第1、2、3外顯子大小分別為373、374、381 bp，與藏雞[19]、三穗鴨[20]完全一致，但與豬[21]不同，符合同源基因的進化關系。

MSTN基因在動物進化過程中高度保守，僅有若干個單核苷酸的同義突變或錯義突變。將靜寧雞和原雞MSTN基因編碼核苷酸序列進行比對發(fā)現：靜寧雞MSTN基因第1外顯子變異最大，存在3處突變（c.60G＞A、c.195C＞G和c.234G＞A）；第3外顯子變異最小，存在1處突變（c.966G＞T）；第2外顯子未發(fā)現多態(tài)。這可能是因為MSTN蛋白功能區(qū)主要集中在第3外顯子編碼的氨基酸序列，其中9個保守性的半胱氨酸對該基因發(fā)揮著主要功能，其改變可能導致靜寧雞MSTN基因功能發(fā)生改變。與溫彥濤等[22]和趙振華等[23]的研究結果相比，c.60G＞A和c.966G＞T是新發(fā)現的2個突變位點。4個SNPs位點均未引起編碼氨基酸變異，屬同義突變。這可能是由于MSTN基因序列和結構的高度保守性，以及密碼子的簡并性使相應的蛋白質未發(fā)生改變[24]。毛亮等[19]研究發(fā)現，藏雞與原雞氨基酸序列同源性高達99.7%，有6個同義突變和1個錯義突變。左斌等[25]在瀘寧雞和米易雞群體中發(fā)現第1外顯子存在2個同義突變，其中g.2100C＞T與雞心臟質量、屠宰率和脛圍顯著相關；BARON等[26]和YE等[27]在肉雞和蛋雞群體中發(fā)現MSTN基因高度多態(tài)，其外顯子1存在7個SNPs，外顯子2存在7個SNPs和1個缺失，外顯子3存在1個突變位點。朱智等[28]發(fā)現MSTN基因第1外顯子的g.2100G＞A和g.2109G＞A突變與溫嶺草雞的屠宰率、腹脂率和胸肌率顯著相關。起源、進化和選育程度的不同，導致靜寧雞與其他家禽品種在MSTN基因核苷酸序列上的差異，但在氨基酸水平上無差異，說明其在核苷酸水平上的差異不影響編碼蛋白的結構組成，這將為從DNA水平上研究品種間起源和進化關系提供一定的理論基礎。MSTN基因在同一物種不同品種間表現出的堿基突變有可能影響蛋白質的空間結構，從而影響其功能，說明該基因具有作為遺傳標記的潛在可能。

基因決定生物性狀最終是通過蛋白質來體現的。蛋白質理化性質預測結果顯示：靜寧雞MSTN蛋白由375個氨基酸折疊而成；總平均親水性為－0.399，依據氨基酸分值越高疏水性越強，分值越低親水性越強的規(guī)律，可見該蛋白為親水性蛋白；不穩(wěn)定指數值大于40，表明該編碼蛋白是不穩(wěn)定蛋白[29]。賈浩等[30]報道了蛋白質半衰期越長則穩(wěn)定性越高，而本研究發(fā)現靜寧雞MSTN具有較長的半衰期（30 h）卻是不穩(wěn)定蛋白，這可能與MSTN蛋白不同生理功能的發(fā)揮存在某種聯系。在20種氨基酸組成中，營養(yǎng)價值較高的亮氨酸（Leu）數目最多（30個），比鴨的少3個，比牛、羊少5～6個；弱堿性的組氨酸（His）數目最少（5個），比羊的多2個。生理條件下是否帶電與周圍內環(huán)境有關。對蛋白質空間結構起關鍵作用的半胱氨酸（Cys）為13個，與鴨、牛、羊的數目相同，說明各種動物MSTN蛋白中的半胱氨酸高度保守；已證實，第3外顯子的9個保守性半胱氨酸殘基就是MSTN基因發(fā)揮正常生物學功能并行使肌肉負調控作用的關鍵。終止α-螺旋的脯氨酸（Pro）為25個，比鴨、羊少1個。通過比較發(fā)現，各種動物MSTN基因編碼區(qū)序列中性質相似的氨基酸數目和在序列中的位置都有不同程度的差異，表明該基因在動物進化過程中存在多態(tài)性。這與易恒潔等[20]關于三穗鴨的預測結果基本一致。

在外顯子中構成編碼區(qū)的核苷酸突變可能引起mRNA二級結構的改變，從而引起蛋白質結構改變而影響其生物學功能。對靜寧雞MSTN基因的mRNA二級結構預測的結果表明：突變前后mRNA二級結構和自由能的改變均會影響其結構的穩(wěn)定性，c.195C＞G和c.234G＞A突變前后的自由能分別降低了2.93和4.61 kJ/mol，結構穩(wěn)定性的提高使蛋白質二級結構也發(fā)生改變；c.966G＞T突變前后的自由能增加了10.88 kJ/mol，穩(wěn)定性降低，蛋白質二級結構改變；c.60G＞A突變前后的自由能未發(fā)生變化。

蛋白質二級結構是多肽鏈依賴氫鍵排列在一維方向上具有周期性結構的構象，對其進行預測和分析有助于了解其三維構象和蛋白質的空間結構。本研究中靜寧雞MSTN二級結構包含169個氨基酸的無規(guī)則卷曲、99個氨基酸的延伸鏈、81個氨基酸的α-螺旋和26個氨基酸的β-轉角，不存在β-折疊。按照α-螺旋比例大于45%，同時β-折疊比例小于5%的蛋白質二級結構分型標準，靜寧雞MSTN蛋白二級結構屬于非混合型蛋白，這種結構是否影響該蛋白的能量代謝、運輸和結合等過程還有待進一步探討，但這一研究結果與鴨、牛、豬完全不同。易恒潔等[20]認為三穗鴨MSTN蛋白二級結構包含22個α-螺旋、26個β-折疊、26個β-轉角和20個無規(guī)則卷曲；杜曉華等[31]的研究表明，西門塔爾牛MSTN蛋白質二級結構是以無規(guī)則卷曲和β-轉角為主的混合型蛋白；王偉等[32]的研究表明，豬MSTN蛋白二級結構含有20.53%的α-螺旋、4%的β-轉角、53.07%的無規(guī)則卷曲和22.4%伸展條的混合型蛋白?？梢?，靜寧雞MSTN蛋白二級結構最大元件是無規(guī)則卷曲，延伸鏈、α-螺旋和β-轉角則散布于整個蛋白質結構中。

4 結論

由于肌肉生長抑制素基因能夠調控動物肌肉生長，使人類獲得更多的動物肉產品，所以其在畜牧生產中具有廣泛的應用前景。本研究對靜寧雞MSTN基因的理化性質和蛋白結構功能進行了系統(tǒng)預測，以期為揭示靜寧雞的肉質性狀提供理論基礎，同時為分子遺傳育種技術應用于生產實踐提供依據。

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