杜麗娜 王超 王芳

摘要：目的 觀察三七總皂苷（PNS）與淫羊藿總黃酮（TFE）聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將30只18月齡SD大鼠隨機(jī)分為自然衰老組和PNS+TFE低、高劑量組，每組10只。另取10只2月齡大鼠為青年對(duì)照組。PNS+TFE低、高劑量組大鼠分別給予10 mg/kg PNS、TFE和20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老組和青年對(duì)照組大鼠給予生理鹽水灌胃。每周連續(xù)給藥6 d，共4個(gè)月。末次給藥后24 h，大鼠稱重后處死，取睪丸組織，稱取質(zhì)量，計(jì)算睪丸指數(shù)。HE染色觀察睪丸組織形態(tài)，TUNEL法檢測(cè)大鼠生殖細(xì)胞凋亡，Western blot檢測(cè)睪丸組織抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax和DNA損傷蛋白γ-H2AX的表達(dá)。結(jié)果 與自然衰老組比較，PNS+TFE低、高劑量組衰老大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)均明顯升高，生精小管組織形態(tài)明顯改善，睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，睪丸組織Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bax和γ-H2AX蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值降低。結(jié)論 PNS與TFE聯(lián)合給藥可延緩自然衰老大鼠生殖功能衰退，其機(jī)制可能與抑制睪丸生殖細(xì)胞的凋亡和DNA損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞：三七總皂苷；淫羊藿總黃酮；衰老；凋亡；DNA損傷；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.008

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0031-04

Abstract： Objective To investigate the effects of panax notoginseng saponins （PNS） combined with total flavonoids from epimedium （TFE） on testicular dysfunction in natural aging rats； To discuss its mechanism of action. Methods Thirty 18-month old male SD rats were randomly divided into natural aging group， PNS combined with TFE low and high dose groups， with 10 rats in each group. Another 10 2-month old rats were set as young control group. PNS combined with TFE low and high dose groups were given gastric gavage of 10 mg/kg PNS combined with 10 mg/kg TFE， and 20 mg/kg PNS combined with 20 mg/kg TFE， respectively. Rats in young control group and natural aging group were given saline for 6 d each week， lasting for 4 months. Then， rats were sacrificed， and the testes were obtained to calculate the testicular weight and the testicular index. The testicular tissue morphology was observed by using HE staining. Testicular germ cell apoptosis was detected by using TUNEL method. The levels of Bcl-2， Bax and γ-H2AX protein expression in testicular tissue were detected by Western blot. Results Compared with natural aging group， low and high dose of PNS combined with TFE significantly elevated the testicular weight and testicular index， improved the histological changes of testicular seminiferous tubule， significantly reduced number of apoptosis of spermatogenic cells in the testis， upregulated the expression of Bcl-2 protein in the testis， downregulated the expression of Bax and γ-H2AX protein， and decreased the ratio of Bax/Bcl-2. Conclusion PNS combined with TFE can improve testicular dysfunction in natural aging rats by inhibiting apoptosis and DNA damage of germ cells.

Keywords： panax notoginseng saponins； total flavonoids from epimedium； aging； apoptosis； DNA damage； rats

三七為五加科人參屬植物，其根莖入藥?，F(xiàn)代藥理研究顯示，三七有延緩衰老和保護(hù)生精功能等作用[1]，其中三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要活性成分。淫羊藿是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽(yáng)中藥，以單味或復(fù)方入藥，應(yīng)用于性功能低下及睪丸病變，有補(bǔ)腎陽(yáng)、抗睪丸衰老的功效，其中淫羊藿總黃酮（total flavonoids from epimedium，TFE）是淫羊藿的主要成分。現(xiàn)代藥理研究顯示，PNS有清除自由基、提高免疫力、拮抗睪丸炎癥損傷、抑制細(xì)胞凋亡等作用[2]；TFE有增強(qiáng)性腺功能、延緩衰老、抗腫瘤等作用[3]。但二者聯(lián)合給藥是否可改善睪丸生殖功能衰退鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以自然衰老大鼠為模型，觀察PNS與TFE聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠，2月齡10只，體質(zhì)量（220±30）g，18月齡30只，體質(zhì)量（500±50）g，均為SPF級(jí)，北京維利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用的準(zhǔn)則。

1.2 藥物

PNS，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，純度>95%；TFE，成都仁誠(chéng)生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%。

1.3 主要試劑與儀器

β-Actin抗體（批號(hào)66009-1-lg），美國(guó)Proteintech公司；促凋亡蛋白Bax抗體（批號(hào)ab182733）、抗凋亡蛋白Bcl-2抗體（批號(hào)ab59348），美國(guó)Abcam公司；DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX抗體（批號(hào)SC-101696），美國(guó)Santa Cruz公司；二抗驢抗兔，美國(guó)Jackson Immuno Research公司；超敏ECL顯影液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒，瑞士Roche公司；苯甲基黃酰氟（PMSF）、RIPA裂解液、磷酸蛋白酶抑制劑，武漢谷歌生物有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司。CS-V1型攤片烤片機(jī)，孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；1X53顯微鏡，日本Olympus公司；PowerPacTM Basic電泳儀、Mini Protean3 Cell電泳槽及蛋白電泳技術(shù)平臺(tái)，美國(guó)Bio-Rad公司；Bioshine ChemiQ4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像自動(dòng)顯影儀，上海歐翔科學(xué)儀器有限公司；Leica TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、Leica EG1150H石蠟包埋機(jī)、Leica EG1150C超薄切片機(jī)，德國(guó)Leica公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

將30只18月齡SD大鼠隨機(jī)分為自然衰老組和PNS+TFE低、高劑量組（中藥低、高劑量組），每組10只，另取10只2月齡大鼠為青年對(duì)照組。中藥低劑量組予10 mg/kg PNS、TFE灌胃，中藥高劑量組予20 mg/kg PNS、TFE灌胃，自然衰老組和青年對(duì)照組予生理鹽水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，每周連續(xù)給藥6 d，周日不給藥，共4個(gè)月。末次給藥24 h后，大鼠稱重，麻醉處死，取出睪丸組織稱重，計(jì)算睪丸指數(shù)[睪丸質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）]。

2.2 HE染色

睪丸組織稱重后，切取部分睪丸組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（厚度5 μm），HE染色，中性樹(shù)脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠睪丸組織形態(tài)。

2.3 TUNEL法檢測(cè)大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡

組織常規(guī)脫蠟，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書操作，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡情況，棕黃色細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2.4 Western blot檢測(cè)大鼠睪丸組織Bax、Bcl-2和γ-H2AX蛋白表達(dá)

稱取所需睪丸組織50～100 mg置于1.5 mL EP管內(nèi)，加入1 mL PBS，冰上充分剪碎，3500 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)多次至上清液無(wú)色。按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑A∶蛋白磷酸酶抑制劑B為100∶1∶1∶1的比例加入350 μL裂解液裂解25 min。12 000 r/min離心10 min后取上清液，加入5×上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min，使蛋白變性。等體積上樣，SDS-PAGE凝膠電泳并恒流轉(zhuǎn)PVDF膜后，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。超敏ECL顯影液A∶B=1∶1配制顯影液，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，圖像分析系統(tǒng)ImagePro Plus 6.0掃描其灰度值，GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用方差分析，組間比較用Dunnett't檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸質(zhì)量與睪丸指數(shù)的影響

與青年對(duì)照組比較，自然衰老組大鼠睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

青年對(duì)照組大鼠睪丸組織生精小管上皮稍厚，生精小管內(nèi)各層次細(xì)胞層數(shù)分明，排列緊密，核質(zhì)分明，可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞；自然衰老組大鼠睪丸組織中生精小管上皮變薄，細(xì)胞數(shù)目較青年對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞層數(shù)明顯減少，排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)目減少；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠上述情況明顯改善，睪丸組織生殖細(xì)胞層次和各級(jí)生精細(xì)胞呈劑量依賴性增加。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.3 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響

與青年對(duì)照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多，且主要表達(dá)于精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4.4 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與青年對(duì)照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組大鼠睪丸組織Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，Bax/Bcl-2比值顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

4.5 三七總皂苷與淫羊藿總黃酮聯(lián)合對(duì)自然衰老大鼠睪丸組織DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX表達(dá)的影響

與青年對(duì)照組比較，自然衰老組大鼠睪丸組織γ-H2AX表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與自然衰老組比較，中藥低、高劑量組γ-H2AX表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖4。

5 討論

衰老是隨年齡增長(zhǎng)機(jī)體逐漸出現(xiàn)退行性變化的過(guò)程，表現(xiàn)為生物體內(nèi)各部分器官系統(tǒng)功能的逐漸衰退。隨著男性年齡的增加，精液參數(shù)及精子功能明顯下降，妊娠等待時(shí)間明顯延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNS和TFE聯(lián)合給藥后自然衰老大鼠的睪丸質(zhì)量與睪丸指數(shù)顯著升高，生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)目明顯增加，各級(jí)生精細(xì)胞均有不同程度的恢復(fù)，提示PNS和TFE聯(lián)合給藥對(duì)自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退具有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制下的程序化死亡，與衰老過(guò)程中器官功能的退化、衰老相關(guān)疾病的發(fā)展密切相關(guān)。有研究報(bào)道，衰老過(guò)程中逐漸增加的凋亡細(xì)胞會(huì)誘發(fā)雄性哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞凋亡增加，使精子數(shù)量減少，從而導(dǎo)致生殖功能減退[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PNS和TFE聯(lián)合可明顯降低衰老大鼠睪丸組織凋亡細(xì)胞數(shù)量。已知Bcl-2基因家族與凋亡密切相關(guān)，Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用，Bax作為Bcl-2基因家族中的一員，對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，Bax/Bcl-2比值對(duì)細(xì)胞的存亡起著決定性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bcl-2蛋白表達(dá)在自然衰老大鼠睪丸組織中顯著降低，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)顯著升高。PNS和TFE聯(lián)合可顯著升高Bcl-2蛋白表達(dá)，降低Bax蛋白表達(dá)。表明聯(lián)合給藥可有效改善衰老大鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡。

DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是衰老公認(rèn)機(jī)制之一，而磷酸化的γ-H2AX與DNA雙鏈斷裂關(guān)系密切[5-6]。γ-H2AX是DNA損傷標(biāo)記物，可反映DNA損傷和細(xì)胞凋亡與衰老的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自然衰老大鼠睪丸組織γ-H2AX蛋白表達(dá)顯著升高，而PNS和TFE聯(lián)合可顯著下調(diào)大鼠睪丸組織γ-H2AX蛋白表達(dá)。表明聯(lián)合給藥可有效拮抗衰老大鼠睪丸組織DNA損傷，從而抑制生殖細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PNS和TFE聯(lián)合給藥對(duì)自然衰老大鼠睪丸生殖功能衰退有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX和生殖細(xì)胞凋亡有關(guān)。但其具體機(jī)理尚未明確，仍需進(jìn)一步研究探討，為臨床研究男性睪丸的衰老提供更加明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鐘曉鳳.三七的藥理作用及其臨床應(yīng)用研究[J].中醫(yī)臨床研究，2015， 9（6）：116-117.

[2] 劉靜，張長(zhǎng)城，韓貴芳，等.三七總皂苷對(duì)自然衰老大鼠睪丸炎癥反應(yīng)和生殖細(xì)胞凋亡的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（5）：644- 649.

[3] 宋來(lái)新，趙海霞，袁丁，等.淫羊藿總黃酮對(duì)自然衰老大鼠睪丸細(xì)胞凋亡及p-P53、p-P38表達(dá)的影響[J].中藥材，2016，39（10）：2347-2350.

[4] JIANG H， ZHU W J， LI J， et al. Quantitative histological analysis and ultrastructure of the aging human testis[J]. Int Urol Nephrol， 2014，46（5）：879-885.

[5] 余應(yīng)年.DNA鏈斷裂與DNA損傷和細(xì)胞凋亡[J].癌變·畸變·突變， 1999，8（6）：280.

[6] 黃鵬程，周長(zhǎng)慧，常艷.基于γ-H2AX生物標(biāo)志物DNA遺傳毒性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2016，25（4）：418-424.

（收稿日期：2018-02-27）

（修回日期：2018-03-26；編輯：華強(qiáng)）