周霞，王延華，張玲玲，孫芬芳，王霞

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院食品系，山東萊陽265200）

隨著生活節(jié)奏的加快，快餐類食品越來越頻繁的走上人們的餐桌。簡單快捷的蛋糕類食品因其優(yōu)美的造型、艷麗的色彩和香甜的口味受到上班族以及兒童的青睞，成為他們的下午茶甚至早餐的重要組成部分。然而蛋糕類食品尤其是裱花蛋糕為了美觀，在制作過程中往往需要添加著色劑（又稱食用色素，簡稱色素）。著色劑主要包括人工合成色素和天然色素兩類。人工合成色素與天然色素相比，具有成本相對低廉、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受熱穩(wěn)定性強(qiáng)、容易著色等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[1]。研究表明，過量攝入合成色素，影響兒童智力發(fā)育，干擾兒童正常代謝功能，并且可能在體內(nèi)蓄積并分解轉(zhuǎn)化成致癌物質(zhì)[2]。GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對合成色素在食品中的使用范圍和限量做了明確的規(guī)定[3]。

目前，食品中合成色素的檢測方法主要有高效液相色譜法[4-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜連用法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]，另外微柱法[11]、導(dǎo)數(shù)伏安法[12]、極譜法[13]、靜電離子色譜法[14]、毛細(xì)管電泳法[15]、分光光度法[16-17]等也有報道。高效液相色譜法因其簡單、高效、成本低廉而受到人們的青睞。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)食品中合成著色劑的測定》對果汁飲料、蜜餞類及著色糖衣制品中7種合成色素的提取和測定做了詳細(xì)的描述。但該方法涉及到的色素種類和樣品種類有限，復(fù)雜基質(zhì)食品中合成色素的簡單、準(zhǔn)確、快速提取測定仍需作進(jìn)一步研究。為此，學(xué)者們做了很多有益的嘗試[18-21]。裱花蛋糕中合成色素的測定目前鮮有報道。裱花蛋糕基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)和油脂含量高，按照GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定》規(guī)定的方法進(jìn)行前處理，提取率和重現(xiàn)性均不能得到很好的保證。本文通過改進(jìn)樣品前處理方法和色譜條件，為裱花蛋糕中合成色素含量測定提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，使用前過濾、脫氣）：瑞典歐普森化工有限公司；乙酸銨（優(yōu)級純，配制成濃度為0.02 mol/L的溶液并過濾、脫氣）：百靈威化學(xué)科技有限公司；乙酸鋅（配制成濃度為21.9%的水溶液備用）、亞鐵氰化鉀（配制成濃度為10.6%的水溶液備用）、無水乙醇、氨水、檸檬酸（配制成20%的水溶液備用）（均為分析純）、聚酰胺粉（100目～200目）：國藥集團(tuán)工業(yè)有限公司；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、新紅：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；聚酰胺小柱（2 g，12 mL）：美國安捷倫科技有限公司；試驗用水均為超純水（電阻率18.3 MΩ/cm2）；裱花蛋糕：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate3000高效液相色譜儀（配紫外檢測器、自動進(jìn)樣器）：美國賽默飛世爾公司；YKTD-360W超聲波清洗機(jī)：北京亞科天達(dá)科技公司；TDL-5000BR臺式冷凍離心機(jī)、LAB DANCER渦旋振蕩器：德國艾卡集團(tuán)；DC-24-RT水浴型氮吹儀：上海安譜實驗科技有限公司；XS104電子分析天平：德國梅特勒-托利多集團(tuán)；FJ200-SH高速分散均質(zhì)機(jī)：上海滬析實驗有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Syncronis C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；柱溫 30℃；流速 0.5 mL/min；進(jìn)樣量 20 μL；紫外檢測器，檢測波長254 nm；流動相：甲醇和乙酸銨（0.02 mol/L，20%檸檬酸調(diào)pH=4.0），梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Elution condition of synthetic pigments by HPLC

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)確移取濃度均為1 mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅和濃度為0.1 mg/mL 的新紅標(biāo)準(zhǔn)品各 0.10、0.25、0.5、0.75、1.0 mL于5個10 mL容量瓶中，用現(xiàn)制的一級水定容至刻度，搖勻，配成新紅濃度為 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL，其他標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 10、25、50、75、100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm的針式過濾器過濾，按照色譜條件進(jìn)行檢測，根據(jù)峰面積和對應(yīng)的濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品處理

將完整的裱花蛋糕切碎，均質(zhì)機(jī)勻漿混勻，稱取2 g（精確至0.01g）樣品于離心管中，加入石油醚10mL，超聲振蕩2 min，棄去石油醚層。加入21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀各2 mL，振蕩搖勻，加入乙醇-氨水（7∶3，體積比）混合溶液5 mL，渦旋混勻，超聲振蕩5 min，5 000 r/min離心5 min，收集上清液。將殘渣繼續(xù)用5 mL乙醇-氨水重復(fù)提取，直至殘渣無色。合并上清液，水浴濃縮至10 mL，待凈化。

用甲醇和水各5 mL活化聚酰胺小柱，重復(fù)3次。將濃縮后的提取液用20%檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至6.0左右，上柱。上樣完成后，先用甲酸-甲醇（4∶6，體積比）混合液3 mL淋洗3次，然后用水洗至流出液為中性，棄去流出液。最后用10 mL乙醇-氨水（7∶3，體積比）混合洗脫液洗脫小柱至無色，將洗脫液合并，水浴蒸發(fā)至近干，然后用水定容至，經(jīng)0.22 μm針式過濾器過濾，在儀器工作條件下進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品的預(yù)處理

裱花蛋糕基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，干擾后續(xù)操作，必須預(yù)先除去。目標(biāo)物8種色素都是水溶性的，不溶于油脂，試驗采用石油醚萃取以除去脂肪，效果良好，對色素的回收率影響可以忽略。由于蛋白質(zhì)吸附色素，試驗采用21.9%乙酸鋅和10.6%亞鐵氰化鉀溶液使蛋白質(zhì)沉淀的同時，加入提取劑提取色素，在超聲波的強(qiáng)力振蕩下，裹夾在蛋白中的色素被釋放進(jìn)入提取劑中。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化

采用聚酰胺固相萃取小柱對提取液進(jìn)行凈化，并與聚酰胺粉吸附法進(jìn)行比較。聚酰胺粉吸附法對操作溫度要求較高（60℃），所需淋洗液和洗脫液體積大，色素回收率尤其是赤蘚紅回收率偏低（78%）。因此，對于含赤蘚紅的樣品，GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測定》中采用液-液分配法進(jìn)行處理。液-液分配法使用大量有機(jī)溶劑，操作繁瑣，試驗結(jié)果受操作條件影響較大，不利于批量處理。試驗聚酰胺粉吸附法和聚酰胺柱固相萃取法兩種凈化方法對合成色素回收率的影響，結(jié)果如表2所示。

結(jié)果表明，聚酰胺柱固相萃取法操作程序簡潔，溶劑使用量較小，8種色素的回收率均明顯提高。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

以甲醇和乙酸銨（0.02 mol/L，20%檸檬酸調(diào)pH=4.0）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，試驗了流速為0.3、0.5、1.0 mL/min時8種合成色素的分離情況。流速為1.0 mL/min時，分析時間較短，但儀器的柱壓增高，柱效也明顯降低，檸檬黃和莧菜紅沒有達(dá)到基線分離。在0.3 mL/min流速下，分析時間延長，峰展寬嚴(yán)重。流動相流速為0.5 mL/min時，8種色素分離良好，峰形尖銳，分析效果好，分析時間適中。綜合出峰時間、色素分離效果、儀器柱壓等因素，最終確定0.5 mL/min為最佳流速。在最佳流速下，對比了柱溫為20、25、30、35℃時目標(biāo)物質(zhì)的分離情況。結(jié)果表明，4個溫度下8種色素均能達(dá)到基線分離。鑒于柱溫大于室溫時，環(huán)境對柱溫影響較小，溫度波動小，所以選擇30℃為測定柱溫。色譜條件優(yōu)化后8種合成色素的色譜圖如圖1所示。

表2 合成色素在兩種凈化方法下回收率比較Table 2 Recovery comparison of synthetic pigment between two purification methods

圖1 8種合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色圖譜Fig.1 Chromatogram of the mixed solution of eight kinds of synthetic pigments

2.3 分析方法評價

2.3.1 方法檢出限及線性回歸方程

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以逐漸減少標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量的方法進(jìn)行試驗，用色譜峰面積是極限噪音的3倍計算檢出限。試驗結(jié)果如表3所示。

從表3中可以看出，用本試驗方法對8種合成色素進(jìn)行分離分析的線性范圍較寬，線性良好，檢出限較低，能夠滿足裱花蛋糕中合成色素檢測要求。

2.3.2 樣品中8種合成色素的加標(biāo)回收率和精密度

選取空白裱花蛋糕樣品，添加不同水平的8種合成色素，按試驗方法制備樣品溶液，在最佳色譜條件下平行測定6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表4所示。

表3 8種合成色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear relationship，correlation coefficient and limit of detection of eight synthetic pigments

表4 樣品加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation for the 8 synthetic pigments in spiked sample（n=6）

由表4可以看出，8種合成色素的加標(biāo)回收率為83.1%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.767%～7.943%，回收率和精密度良好。

2.3.3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗

將提取凈化后的凈化液放入冰箱-4℃冷藏，每1、4、8、12、24、48、168 小時將樣品取出，恒溫至室溫后上機(jī)檢測，比較放置時間對樣品溶液中目標(biāo)物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，樣品溶液在冰箱-4℃冷藏放置一周，各色素出峰時間無明顯變化，色譜峰重現(xiàn)性良好，說明樣品溶液在-4℃冷藏的條件下一周時間內(nèi)不影響試驗結(jié)果，本方法適合于批量樣品的處理檢測。

2.4 樣品測定

利用優(yōu)化后的樣品前處理方法和色譜測定條件，測試了萊陽常見品牌不同類型、不同尺寸12批裱花蛋糕中8種合成色素的含量，樣品類型涉及奶油裱花蛋糕、巧克力裱花蛋糕、水果裱花蛋糕，樣品外觀上包含色彩艷麗的和純奶油色2種。其中樣品11為奶油色裱花蛋糕，樣品12有紅色和黃色裝飾，其余10個樣品均有艷麗的外觀。裱花蛋糕中合成色素的測定結(jié)果見表5。

表5 裱花蛋糕中合成色素的測定結(jié)果Table 5 The determination results of synthetic pigments in different samples

由表5可知，樣品11、12未檢測出目標(biāo)物質(zhì)，其余10個樣品均不同程度的檢出合成色素。樣品11沒有艷麗的外觀，應(yīng)該不含合成色素，所以沒有檢出；樣品12外觀艷麗但未檢出目標(biāo)物質(zhì)，推測其使用了天然色素，有待進(jìn)一步確認(rèn)。其他樣品外觀艷麗，均檢出了不同種類、不同含量的合成色素。GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對糕點(diǎn)上彩裝中8種合成色素的限量規(guī)定分別是新紅0.05 g/kg、檸檬黃0.1 g/kg、莧菜紅0.05 g/kg、胭脂紅 0.05 g/kg、日落黃 0.1 g/kg、誘惑紅 0.05 g/kg、亮藍(lán) 0.025 g/kg、赤蘚紅0.05 g/kg。

從表5中可以看出，檢測樣品均未超標(biāo)使用色素，但不同樣品色素含量及種類差別較大。

3 結(jié)論

1）在超聲波振蕩作用下，利用石油醚除油脂、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀沉淀蛋白聯(lián)合乙醇氨水混合溶液提取，聚酰胺固相萃取小柱凈化，高效液相色譜法分離檢測，實現(xiàn)了裱花蛋糕中的8種合成色素新紅、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅的高效、快速、準(zhǔn)確測定。

2）通過對實際樣品的測定，可以得知裱花蛋糕中合成色素主要來源于裱花過程中的人為添加。對于沒有艷麗顏色的純奶油色裱花蛋糕，沒有必要添加色素，相對更健康。由于不同花色對顏色需求不同，導(dǎo)致蛋糕中合成色素的含量差別比較大。市售蛋糕中有使用天然色素調(diào)色的，但比例偏低，需要相關(guān)部門進(jìn)行適當(dāng)?shù)囊龑?dǎo)和監(jiān)督。

3）本試驗處理樣品時將蛋糕胚和奶油一同均質(zhì)測定，使得測定結(jié)果偏低，均沒有超出最大使用限量。如果有消費(fèi)者更喜愛吃裱花蛋糕上的裝飾奶油，不吃蛋糕胚，則本試驗結(jié)果不能作為參考。裱花蛋糕上的裝飾奶油中的合成色素含量有待進(jìn)一步研究。