尹倩 王小琴

骨骼肌收縮依賴(lài)結(jié)構(gòu)和功能完整的肌球蛋白重鏈異構(gòu)體[5]。肌球蛋白重鏈(MHC)通過(guò)復(fù)雜組合形成的肌球蛋白，是肌原纖維粗絲的組成單位。肌球蛋白具有收縮調(diào)節(jié)功能,對(duì)骨骼肌纖維收縮起重要作用。研究顯示, 骨骼肌的可塑性與肌球蛋白重鏈異構(gòu)體的種類(lèi)、組成及相互轉(zhuǎn)化關(guān)系密切，免疫組化和基因研究發(fā)現(xiàn)僅咬肌纖維就表達(dá)了4種不同的肌球蛋白重鏈異構(gòu)體[6]。對(duì)于I類(lèi)肌球蛋白基因(MYO1H)，第30外顯子中單核苷酸多態(tài)性可導(dǎo)致野生型堿基G突變?yōu)锳，從而使脯氨酸與原鏈中第1001位的亮氨酸發(fā)生置換。單核苷酸多態(tài)性是指DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性。SNPs廣泛存在于基因組中，是一種穩(wěn)定遺傳的早期病變，與疾病相關(guān)[7]。它是繼限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性、簡(jiǎn)單重復(fù)序列之后的第3代分子遺傳標(biāo)記。其中MYO1H的rs3825393多態(tài)位點(diǎn)被報(bào)道與南亞人群MR發(fā)生顯著相關(guān)[8]，由于東、南亞人群存在地域和種族差異,因此本實(shí)驗(yàn)以國(guó)內(nèi)山西太原地區(qū)人群為研究對(duì)象，對(duì)MYO1H rs3825393多態(tài)位點(diǎn)與該疾病的相互關(guān)系及影響進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

對(duì)照組：①Ⅰ類(lèi)骨面型，磨牙中性關(guān)系；②頭顱側(cè)位片顱底角=127.3°±3.8°，下頜角=119.8°±5.6°、后前面高比=0.65±0.04、上下頜大小形態(tài)正常：∠SNA=78°～86°，∠SNB=76°～84°，∠ANB=2°～ 4°。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集和DNA提取 知情同意后，分別抽取空腹肘靜脈血液樣本3 ml，EDTA抗凝處理。使用DNA Blood Mini kit(OMEGA)試劑盒并根據(jù)使用說(shuō)明提取兩組患者全基因組DNA，-4 ℃保存。

1.2.2 MYO1H rs3825393多態(tài)位點(diǎn)目的基因擴(kuò)增應(yīng)用Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，序列為F5’-GGCTTACTTCCCTCCCAGAG-3’，R5’-CTGTGGCAACAGCATTCTTC-3’(Invitrogen合成)。使用聚合酶鏈法擴(kuò)增DNA樣本內(nèi)目標(biāo)序列，PCR反應(yīng)體系：DNA模板50～100 ng，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μl(TransGen，中國(guó))，上下游引物各1 μl(10 pmol/L)，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足總體積至25 μl，混勻。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min，循環(huán)條件94 ℃ 1 min，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析證實(shí)PCR擴(kuò)增成功。取PCR產(chǎn)物5 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DI 2000 DNA marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，電泳完畢后用凝膠成像分析系統(tǒng)照相并保存。

1.2.3 酶切和多態(tài)性檢測(cè) 取純化后的PCR產(chǎn)物10 μl加入總體積25 μl的酶切反應(yīng)體系中，體系內(nèi)還有：2U Sau96I內(nèi)切酶(BioLabs，America), 2 μl酶切緩沖液，無(wú)菌去離子水補(bǔ)至25 μl，37 ℃水浴2 h。酶切片段在1.5%瓊脂糖凝膠上以120 V電壓電泳30 min，結(jié)束后于紫外燈下根據(jù)酶切圖譜判斷基因型。具體酶切位點(diǎn)為5’…GG(N) CC…3’和3’…CC(N) GG…5’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析2 組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律?；蛐汀⒌任换蚍植技捌渑c易感性的關(guān)系采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，采用χ2檢驗(yàn)比較2 組在基因型和等位基因分布上是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 2 組患者基線資料及頭影測(cè)量值比較

病例組和對(duì)照組性別、年齡比較差異無(wú)顯著性(P>0. 05)(表 1)；SNB、ANB角在2 組間有顯著差異，其余測(cè)量值在2 組間均相似，證明所選MR患者及對(duì)照者符合診斷及納入標(biāo)準(zhǔn)，具有代表性(表 2)。

表 1 2 組患者基線資料

表 2 基因型間頭影測(cè)量值比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2 組MYO1H rs3825393位點(diǎn)基因型分布經(jīng) Pearsonχ2檢驗(yàn)均符合 Hardy-Weinberg平衡，具有代表性(表 3)。

表 3 對(duì)照組與病例組遺傳平衡性檢測(cè)結(jié)果

2.3 目的基因擴(kuò)增和酶切分析

目的基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為302bp(圖 1)，Sau96I酶切后，野生GG型(76bp和226bp)者為2 條電泳帶；G→A突變后產(chǎn)生一個(gè)酶切位點(diǎn)，雜合突變AG型(76bp，226bp，302bp)者為3 條電泳帶；純合突變AA型(302bp)者只有1 條電泳帶(圖 1～2)。

圖 1 MYO1H基因rs3825393位點(diǎn)擴(kuò)增電泳圖

圖 2 MYO1H基因rs3825393位點(diǎn)產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Sau96I酶切后的電泳圖

2.4 MYO1H rs3825393位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較

本實(shí)驗(yàn)中GG型共35 例，其中對(duì)照組24 例，病例組11 例；AG型37 例：對(duì)照組13 例，病例組24 例；AA型8 例：對(duì)照組3 例，病例組5 例。3 種基因型在對(duì)照組中分布分別為60%、 33%、7%，在病例組中分別為27%、60%、13%，2 組間基因型分布差異有顯著性(表 4)。等位基因G、A在對(duì)照組中數(shù)量、占比分別為61(76.2%)、19(23.8%)，在病例組中數(shù)量、占比分別為46(57.5%)、34(42.5%)，分布在2 組間有顯著性差異(表 5)。

表 4 2 組患者M(jìn)YO1H rs3825393位點(diǎn)基因型分布 (%)

Tab 4 The distribution of MYO1H rs3825393 target genotype in the 2 groups (%)

注： ①GG/AG/AA 2 組間基因型分布差異有顯著性

表 5 2 組患者M(jìn)YO1H rs3825393位點(diǎn)等位基因分布(%)

注： ①G型和A型等位基因頻率2 組間差異有顯著性

2.5 多因素分析

采用Logistic回歸法分析年齡、性別及MYO1H多態(tài)性與MR易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示整個(gè)回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MR與基因型有相關(guān)性(P<0.05)；與年齡、性別無(wú)相關(guān)性(P>0.05)(表 6)。

表 6 多因素分析結(jié)果

注：χ2=10.373，P=0.035

3 討 論

MR是一類(lèi)發(fā)育性疾病，病因包括環(huán)境、遺傳及二者相互作用。研究顯示環(huán)境因素對(duì)MR起一定作用：局部因素如不良習(xí)慣,替牙障礙，肌平衡失調(diào)等；全身疾病如佝僂病，炎癥如中耳炎等會(huì)影響髁突及下頜骨發(fā)育；下頜骨及髁突外傷也會(huì)造成下頜骨發(fā)育障礙。

Richards等[8]對(duì)MR患者和下頜正常者進(jìn)行了MYO1H SNP分析，通過(guò)比較第30外顯子間的差異，發(fā)現(xiàn)rs3825393多態(tài)位點(diǎn)增加了MR的風(fēng)險(xiǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳圖中，對(duì)照組中有3 例出現(xiàn)1 個(gè)條帶-302bp，代表基因型為AA純合子；有24 例出現(xiàn)2 個(gè)條帶-76bp，226bp，代表基因型為GG純合子；有13 例出現(xiàn)三個(gè)條帶-76bp，226bp，302bp，代表基因型為AG雜合子。同樣，病例組中有5 例電泳結(jié)果出現(xiàn)一個(gè)條帶，基因型為AA；11 例出現(xiàn)2 個(gè)條帶，基因型為GG；24 例出現(xiàn)3 個(gè)條帶，基因型為AG。而判斷等位基因時(shí)，將雜合子的一半認(rèn)為是等位基因G，另一半認(rèn)為是等位基因A。經(jīng)χ檢驗(yàn)，2 組間等位基因和基因型分布差異均有顯著性。病例組中AG基因型數(shù)量明顯高于其他兩型，A等位基因的攜帶頻率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明國(guó)內(nèi)漢族骨性MR人群在MYO1H rs3825393多態(tài)位點(diǎn)處由G突變?yōu)锳占很高的比例，攜帶AG、AA基因型的人群增加了MR的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究首次報(bào)道國(guó)內(nèi)漢族人群MYO1H rs3825393多態(tài)位點(diǎn)與MR的相關(guān)性，但目前MR的致病機(jī)制尚處于初步探索階段，不可否認(rèn)遺傳因素在其發(fā)病中占重要地位，MYO1H 也與下頜骨發(fā)育關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)該基因的一個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了探究，并未探討該基因啟動(dòng)子、內(nèi)含子及編碼區(qū)的其余多態(tài)位點(diǎn)，因此不能排除其他突變與MR存在作用的可能性。本研究在樣本量及地域方面存在一定局限性， 下一步擬采用基因測(cè)序方法對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)該疾病也與環(huán)境因素有關(guān)，擬后期行多因素分析。

(收稿： 2017-12-14

修回： 2018-02-03)