李姣 段曉峰

據(jù)報道每年新增口腔癌約2.75 萬例，其發(fā)病率約占全部惡性腫瘤的25%[1],其中口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是頭頸部最常見的的惡性腫瘤之一，約占頭頸部癌的90%。5 年生存率僅50%～60%[2]，其對患者的生活健康有著巨大的影響,早期即可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率達(dá)到37%～58%[3]。腫瘤的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移特性是造成患者死亡的最重要原因。GRB7作為一種信號聯(lián)結(jié)蛋白，主要介導(dǎo)某些細(xì)胞表面受體和特異性下游信號的耦聯(lián)，與細(xì)胞增殖及腫瘤表達(dá)有著重要的影響。目前研究已經(jīng)證實GRB7在一些惡性腫瘤組織中，如乳腺癌，食管癌，胃癌等，尤其是高轉(zhuǎn)移性腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)[4]。然而，目前有關(guān)GRB7在OSCC中的表達(dá)情況，國內(nèi)外研究較少。本文旨在通過qPCR技術(shù)檢測OSCC和正?？谇火つそM織中GRB7的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與OSCC臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2016-06～2017-06我院收治的65 例患者收集標(biāo)本，其中OSCC 44 例(均經(jīng)病理診斷明確，術(shù)前均未行化療、放療)，男28 例，女16 例，年齡37～81 歲(61.77±10.64)；其中高分化20 例，中分化13 例，低分化11 例，TNM分期顯示：I期和II期患者共12 例，III例和IV期患者共32 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例。正常口腔黏膜標(biāo)本21 例，男12 例，女9 例(20.95±13.90) 歲，正?？谇唤M織主要取自阻生齒拔除術(shù)中多余的牙齦或黏膜組織，所取患者均無全身系統(tǒng)疾病史。組織標(biāo)本均必須在手術(shù)切除術(shù)后立即完成采集，并放入RNA later液保存，4 ℃過夜后，-80 ℃冰箱保存。

1.2 引物合成

所用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計并合成。GRB7,上游：TCTGTGTCAAGCCCAACAAG；下游：CGTACTTGAAGAGGCGGAAG。內(nèi)參基因β-action,上游：ACCGAGCGCGGCTACAGC;下游：CTCATTGCCAATGGTGAT。

1.3 試劑及PCR技術(shù)

切取1～2 mm3大小組織，利用Dynabeads mRNA DIRECTTM試劑盒(Roche公司,美國)，使用磁珠法提取組織mRNA:取切取好的組織溶解于LB裂解液(含蛋白溶解酶K)，可置于55 ℃水浴鍋促進(jìn)組織消化。加入Dynabeads磁珠搖床10 min，使之與mRNA結(jié)合，立即放入磁力架中。移除上清液，用Washing Buffer A液洗滌2 次，B液洗滌1 次，去除上清液。加入Tris-HCl(pH 7.5)溶液，80 ℃恒溫2 min得到mRNA。用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(-20 ℃儲存；SYBR Green I Master備用)。再用Light Cycler R480 SYBR Green I Master(Roche公司)進(jìn)行擴(kuò)增。采用10 μl反應(yīng)體系: SYBR Green I Master 5 μl,上下游引物各2.0 μl，模板1 μl。在進(jìn)行PCR檢測時完成布板的96 孔板放入CFX connect Real Time System PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD，美國)將加樣進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件。反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min，變性95 ℃，10 s，退火65 ℃，6 s，共63 個循環(huán)，于每次循環(huán)最后一步采集熒光信號。每個樣品設(shè)置1 個復(fù)孔，取CT平均值，采用2-△CT分別記錄OSCC組內(nèi)和正常口腔黏膜組內(nèi)GRB7相對于β-action的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

檢測結(jié)果結(jié)合臨床資料數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

GRB7 mRNA在OSCC中的表達(dá)明顯高于口腔正常黏膜組織(圖 1)。其在44 例OSCC及21 例口腔正常組織中的表達(dá)分別為(1.067±0.607)，(0.466±0.315)，Z=-3.836，P<0.01。

圖 1 不同樣本中GRB7 mRNA的表達(dá)

OSCC組中不同臨床特征間的比較結(jié)果如表 1所示，不同性別、年齡的患者GRB7 mRNA表達(dá)之間沒有明顯差異(P>0.05),但是腫瘤不同的分化程度，TNM臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)據(jù)中的兩組患者GRB7 mRNA表達(dá)有差異(P<0.05)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，高分化組患者GRB7表達(dá)顯著高于中低分化組患者。臨床I、II期患者GRB7表達(dá)高于臨床III、IV期患者，臨床上發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者GRB7表達(dá)高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。

表 1 GRB7 mRNA表達(dá)與OSCC臨床特征的相關(guān)性

3 討 論

近年來，針對腫瘤的增殖侵襲和轉(zhuǎn)移這一特點，國內(nèi)外學(xué)者投入了大量研究，以期探索腫瘤發(fā)展過程中其增殖侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。其中，GRB7由Margolis等[5]1992年首次提出就立即引發(fā)了科研工作者對于其功能及機(jī)制的探索。GRB7是GRB7蛋白家族的成員之一，這個家族還包括GRB10和GRB14兩種蛋白。GRB7作為一種重要的沒有內(nèi)源性酶活性的銜接蛋白，主要通過其SH2結(jié)構(gòu)域與許多酪氨酸激酶和其他信號分子連接，介導(dǎo)某些細(xì)胞表面受體和特異性下游信號的偶聯(lián)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[6]，因此近年來逐漸成為研究熱點。人們首先通過研究發(fā)現(xiàn)，GRB7的酪氨酸磷酸化狀態(tài)是其發(fā)揮調(diào)節(jié)和功能的重要狀態(tài)。表皮生長因子[7]，EphB1[8]、細(xì)胞外基質(zhì)[9]和粘著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)[10-11]都被證實可以影響腫瘤的酪氨酸磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖以及腫瘤化[7,11]。一方面，GRB7可以影響細(xì)胞的遷移過程：GRB7和FAK通過其SH2結(jié)構(gòu)域來定位其與病灶的連接及調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移。我們也發(fā)現(xiàn)GRB7作為FAK的直接底物，F(xiàn)AK與GRB7的結(jié)合可以增加整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附過程，其酪氨酸磷酸化狀態(tài)對于其加速細(xì)胞的遷移起著至關(guān)重要的作用[10]。EphB1可以刺激細(xì)胞外基質(zhì)依賴性激酶中成纖維細(xì)胞的能動性，這與GRB7是密切相關(guān)的。GRB7和EphB1的共同表達(dá)可以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的活性，然而EphB1與GRB7 SH2結(jié)構(gòu)域的共表達(dá)卻可以阻斷EphB1調(diào)節(jié)的細(xì)胞遷移過程[8]。另一方面，GRB7在細(xì)胞增殖方面也有著重要的作用[11-13]，包括：FAK介導(dǎo)的GRB7特異性酪氨酸殘基磷酸化可以通過激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[11]。相反，慢病毒編碼GRB7的小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAs會減少細(xì)胞增殖及減緩細(xì)胞的生長[7,11]。相關(guān)研究表明[14-15]：c-Jun氨基末端激酶介導(dǎo)的Pin1/GRB7可以通過一系列復(fù)雜的機(jī)制影響cyclin/CDKs對于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。GRB7的失調(diào)可以加快細(xì)胞G2/M的轉(zhuǎn)化過程，從而達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的目的。

目前，有學(xué)者利用免疫印跡技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法對兩株卵巢癌細(xì)胞A2780cp和OVCA433中GRB7的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果證實了GRB7在卵巢癌中的高表達(dá)[16]。另外，也有學(xué)者對58例胃腸道間質(zhì)瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRB7在腫瘤組織中的陽性率為83.3%，并隨著胃腸間質(zhì)瘤惡性分級的增高，其表達(dá)出現(xiàn)遞增趨勢，差異有顯著性意義[17]。在乳腺癌研究中，也已經(jīng)通過免疫組織化學(xué)法證實了GRB7在乳腺癌中的高表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示GRB7 mRNA在OSCC中表達(dá)較正?？谇火つそM高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這與過往報道中GRB7在腫瘤組織中的高表達(dá)具有一致性。同時，本實驗探索GRB7與臨床特征相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)GRB7與OSCC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期具有顯著相關(guān)性。這與有學(xué)者通過體外實驗證明沉默GRB7可以抑制癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，證實了GRB7高表達(dá)會引起其侵襲和轉(zhuǎn)移的活性改善[18]的結(jié)論具有一致性。推測其可能機(jī)制在于：①GRB7可以依靠羧基端SH2結(jié)構(gòu)域參與介導(dǎo)FAK受體和EPHB1受體的信號通路，調(diào)控細(xì)胞遷移，與腫瘤轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[19]。②激活ERK/FOXM1信號通路，活化的ERK使AP-1磷酸化，最終使促腫瘤細(xì)胞侵襲物質(zhì)含量增加，如Ezrin、組織蛋白酶L、基質(zhì)金屬蛋白酶-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-3、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等[20]。針對GRB7在OSCC中的表達(dá)情況及其通過何種路徑被激活，有待進(jìn)一步實驗研究，GRB7及其下游相關(guān)信號分子在口腔鱗癌中的表達(dá)情況的研究也將成為下一階段的研究方向，從分子水平對OSCC進(jìn)行全面地了解[21]。