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消退素(Resolvin)是由ω-3 多不飽和脂肪酸衍生的新的一種內(nèi)源性促炎癥消退介質(zhì)，具有抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)促炎介質(zhì)等生物學(xué)效應(yīng)[1]。人工合成消退素可能具有促進(jìn)牙周炎炎癥消退，從而達(dá)到治療牙周炎的目的[2]。本實(shí)驗(yàn)研究消退素D1(Resolvin D1，RvD1)對(duì)牙周炎大鼠牙周狀況及齦溝液炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

RvD1(Sigma公司,美國(guó))；濾紙條、4#縫線(博士德公司)；蠟塊(博仁生物)；切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；牙周探針(豪孚迪器材公司)；ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立

清潔級(jí)SD雄性大鼠30 只，4 周齡，體質(zhì)量100～150 g(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。大鼠牙周炎模型的建立：30 只大鼠用10%水合氯醛全麻后，使用牙科探針對(duì)大鼠右上頜第二磨牙牙齦進(jìn)行分離，分離牙齦后使用縫線4#(直徑0.040 mm)放入齦溝內(nèi)并結(jié)扎固定，在結(jié)扎固定過(guò)程中縫線盡量放入大鼠的齦溝內(nèi)，將結(jié)扎端轉(zhuǎn)至頰側(cè)作為口腔微生物的滯留裝置誘導(dǎo)牙周炎的產(chǎn)生，術(shù)后按牙周炎食譜喂養(yǎng)2 周[3-4]。

1.3 分組與檢測(cè)

建模成功后將30 只清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為5 組(n=6)。A組為牙周炎對(duì)照組，B、C、D、E組為治療組。檢測(cè)各組大鼠牙周探診深度(PD)、松動(dòng)度，并收集和檢測(cè)各組大鼠齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達(dá)情況。然后通過(guò)尾靜脈注射一次性給藥的方法對(duì)B、C、D、E組分別給予1、10、50、100 ng/ml不同濃度的RvD1進(jìn)行干預(yù)。用藥后7 d再次檢測(cè)各組相應(yīng)指標(biāo)。

齦溝液收集和檢測(cè)方法如下：將烘烤干燥的濾紙條置于大鼠第二磨牙腭側(cè)近遠(yuǎn)中采集齦溝液，每牙8 根，每根15 s，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA方法檢測(cè)齦溝液IL-1β、TNF-α、IL-6 濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 牙周狀況變化

建模第2周，大鼠第二磨牙有牙周袋形成，均有Ⅰ～Ⅲ度松動(dòng)。B、C、D、E組經(jīng)不同濃度的消退素治療7 d后，牙齦紅腫明顯好轉(zhuǎn)，松動(dòng)度減輕，牙周探診深度變淺，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖 1)。

圖 1 各組大鼠PD值

2.2 大鼠齦溝液中IL-1β、TNF-α、IL-6水平變化

ELISA結(jié)果顯示，治療前各組間比較IL-1β、TNF-α、IL-6差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療前后比較，IL-1β在各組中(包括對(duì)照組)表達(dá)差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但對(duì)照組水平最高，E組(100 ng/ml組)最低，各治療組間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2)；TNF-α的表達(dá)，對(duì)照組前后差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中D組(50 ng/ml)、E組(100 ng/ml)差別具有顯著性(P<0.001)，各治療組間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3)；IL-6的表達(dá)，對(duì)照組前后差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各治療組前后差別也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，各治療組間比較差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， IL-6的表達(dá)隨著RvD1濃度的升高而降低，具有一定的RvD1濃度依賴性(圖 4)。

圖 2 治療前后各組大鼠齦溝液中IL-1β水平

圖 3 各組大鼠齦溝液中TNF-α水平

圖 4 各組大鼠齦溝液中IL-6水平

3 討 論

RvD1是一種新型內(nèi)源性抗炎促消退介質(zhì)，通過(guò)阻礙白細(xì)胞浸潤(rùn)、下調(diào)炎癥介質(zhì)、促進(jìn)凋亡的中性粒細(xì)胞及細(xì)胞碎片的吞噬攝取等方式，在炎癥早期發(fā)揮促進(jìn)炎癥消退的作用[2]。有研究報(bào)道，消退素對(duì)于炎性疾病如：牙周病、哮喘、膿毒癥及視網(wǎng)膜病變等，顯示出了良好的抗炎促消退作用[5]。Garcia等[6]發(fā)現(xiàn)RvD1不僅能顯著降低關(guān)節(jié)炎模型大鼠的痛覺過(guò)敏，同時(shí)還檢測(cè)到炎癥因子TNF-α和 IL-1β的釋放減少了。一項(xiàng)關(guān)于慢性胰腺炎所致痛覺過(guò)敏的研究中，RvD1不僅降低了炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6的釋放，而且發(fā)揮了顯著的抑制痛覺過(guò)敏的效應(yīng)[7]。

消退素的功能主要是抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)可降低中性粒細(xì)胞表面CD18分子的表達(dá)、抑制白細(xì)胞在血管壁的滾動(dòng)、減少白細(xì)胞向炎癥部位滲出和聚集[8-9]。D類消退素可在在盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥中顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-17等促炎細(xì)胞因子的水平[10]。本研究成功建立了大鼠牙周炎模型，經(jīng)過(guò)給大鼠牙齒綁線的方法，并按照牙周炎食譜喂食，2 周后即可形成牙周炎。在建模兩周內(nèi)，大鼠活動(dòng)輕度減少，出現(xiàn)少食、掉毛、體重減輕等癥狀。2周后發(fā)現(xiàn)綁線的牙齒的牙齦紅腫明顯，線周圍有較多食物殘?jiān)鼫簦皆\極易出血，有深牙周袋形成，牙齒松動(dòng)明顯。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)取患牙齦溝液行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)注射消退素后發(fā)現(xiàn)，大鼠牙周炎癥狀明顯改善，PD明顯減少，松動(dòng)度也恢復(fù)正常。齦溝液內(nèi)的TNF-α、IL-1β、IL-6明顯低于用藥前(對(duì)照組)，這提示RvD1是通過(guò)抑制炎癥因子的釋放從而減輕大鼠牙周炎的癥狀。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組TNF-α、IL-1β、IL-6水平也均出現(xiàn)不同程度降低，而且IL-1β前后差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均值均高于治療組，可能因?yàn)楸狙芯垦乐苎啄Ｐ蜑槿藶閯?chuàng)傷輔助食物喂養(yǎng)引起，各炎癥因子在炎癥早期水平較高，轉(zhuǎn)為慢性后逐漸降低，呈現(xiàn)由啟動(dòng)到消退的高度有序化過(guò)程，在炎癥消退階段，炎癥的終止受到機(jī)體內(nèi)源性促炎癥消退介質(zhì)(pro-resolving mediator)的調(diào)控[11]。本實(shí)驗(yàn)提示輔以人工合成消退素，可能促進(jìn)炎癥的消退。

有研究提示，RvD1可能是通過(guò)抑制了嗜中性粒細(xì)胞招募炎性因子的再聚集，以及激活吞噬細(xì)胞清除病原體的作用[12]。另外，RvD1可抑制多形核中性白細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)牙周組織的再生，保護(hù)牙槽骨的破壞，促進(jìn)組織愈合以及重建破壞的牙槽骨[13]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，較小濃度的RvD1即可抑制IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放。在1 ng/ml的RvD1作用下，IL-1β、TNF-α、IL-6與對(duì)照組比較，均有明顯的抑制作用，且IL-6具有RvD1的濃度梯度依賴性，隨著RvD1濃度的升高而升高。近期有研究發(fā)現(xiàn)，RvD1能有效減輕關(guān)節(jié)炎大鼠機(jī)械痛敏，并減少炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放，可能是通過(guò)對(duì)p-ERK通路的抑制來(lái)發(fā)揮作用的，且NF-κB/p65也被顯著激活，這提示RvD1下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，與這2 個(gè)通路相關(guān)且相互作用，發(fā)揮強(qiáng)有力的促炎消退的作用[14-15]。綜上所述，RvD1可有效地減輕牙周炎的癥狀，促進(jìn)牙周組織的愈合，促進(jìn)骨組織的重建和牙周組織的再生，這可能與RvD1下調(diào)炎癥因子，激活吞噬細(xì)胞或抑制中性粒細(xì)胞對(duì)炎癥因子的募集作用有關(guān)，但其中確切的機(jī)制作用需更多的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。