黃銀莉 周洪 盧曉云 蘇曉霞 鐘天宇

口腔頜面部骨組織工程技術(shù)的研究主要集中在種子細(xì)胞、支架材料和調(diào)控因素等方面。hPDLSCs因其來(lái)源受限、細(xì)胞產(chǎn)量較低、存在混雜細(xì)胞等缺點(diǎn)，尋找新的替代種子細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)。hUCWJMSCs因其在細(xì)胞增殖、多向分化、免疫特性以及旁分泌等方面更具優(yōu)勢(shì)，引起廣泛的關(guān)注[1]；其成骨能力已被許多學(xué)者證實(shí)并應(yīng)用于骨組織工程[2-3]。本課題組前期已在體外對(duì)2 種干細(xì)胞成骨分化能力進(jìn)行研究，但結(jié)合支架材料的成骨分化能力的研究尚缺乏。PHBV、PHBHHx是PHAs家族中研究比較多的成員，因其具有良好的無(wú)毒性、生物相容性、可降解性目前廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外hUCWJMSCs、hPDLSCs復(fù)合PHBV、PHBHHx支架，研究hUCWJMSCs成為牙周骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

PHBHHx、PHBV支架(西安交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心)DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco,美國(guó))；L-抗壞血酸2-磷酸鹽、地塞米松、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國(guó))；ALP半定量試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；茜素紅、倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；熒光顯微鏡(Leica DM4000B，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞與支架粘附率測(cè)定 支架預(yù)備：將PHBHHx和PHBV膜裁剪成1 cm2大小，75%酒精浸泡過(guò)夜。然后置于無(wú)菌的24 孔培養(yǎng)板中，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線正反面各照射1 h，每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，直到培養(yǎng)液全部滲透進(jìn)支架中，然后PBS 清洗支架3 次，自然晾干，備用。

取24 孔培養(yǎng)板，在孔內(nèi)植入備用的無(wú)菌PHBHHx和PHBV支架，取生長(zhǎng)良好的P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/孔接種到制備好的支架上，置于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別在4、8、12、24 h后取出支架復(fù)合體，PBS液沖洗，去除未粘附細(xì)胞、消化收集并計(jì)數(shù)，得出流失的細(xì)胞數(shù)；

再將細(xì)胞支架復(fù)合體于新的24孔板培養(yǎng)24 h后，將其輕輕振蕩并收集培養(yǎng)液中細(xì)胞并計(jì)數(shù)，為未粘附細(xì)胞數(shù)。每個(gè)樣本3 個(gè)復(fù)孔。

細(xì)胞粘附率=(接種細(xì)胞數(shù)-流失細(xì)胞數(shù)-未粘附細(xì)胞數(shù))/(接種細(xì)胞數(shù)-流失細(xì)胞數(shù))×100%

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞與支架結(jié)合后細(xì)胞增殖情況

取PHBHHx和PHBV 2 種膜，每組平行對(duì)照3 個(gè)，每孔置1 塊材料，置于24 孔培養(yǎng)板上預(yù)濕，不加膜組作為陰性對(duì)照；將hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種細(xì)胞分別接種于材料及陰性對(duì)照孔中，每孔加0.5 ml培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，波長(zhǎng)為570 nm，收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞與支架結(jié)合后成骨分化能力測(cè)定

1.2.3.1 細(xì)胞接種與誘導(dǎo) 將hUCWJMSCs和hPDLSCs接種于放置支架的 24 孔板中，接種密度為每個(gè)孔103個(gè)細(xì)胞，加入普通培養(yǎng)基培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到 70%～80%的時(shí)候，將培養(yǎng)基換為成骨分化培養(yǎng)液，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：DMDM/F12培養(yǎng)基，100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，0.25 μg/ml兩性霉素B、終濃度10%FBS，10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油及50 μmol /L的L-抗壞血酸-2-磷酸。3 d換1 次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)21 d；用普通培養(yǎng)基同時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞，其它培養(yǎng)條件與成骨分化組相同，做為陰性對(duì)照。

1.2.3.2 堿性磷酸酶(ALP)半定量檢測(cè) hUCWJMSCs和hPDLSCs分別和PHBHHx、PHBV膜接種于24 孔板中，細(xì)胞總量為103個(gè)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，分別在培養(yǎng)1、3、5、7、14、21 d收集細(xì)胞進(jìn)行ALP定量檢測(cè)。檢測(cè)步驟按ALP半定量試劑盒進(jìn)行。

1.2.3.3 茜素紅染色 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別和PHBHHx、PHBV膜接種于24 孔板中，細(xì)胞總量為103個(gè)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)21 d。對(duì)照組為細(xì)胞和支架結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，21 d后分別進(jìn)行茜素紅染色。

1.2.4 細(xì)胞與支架結(jié)合后掃描電鏡觀察 無(wú)菌條件下，收集生長(zhǎng)良好的hUCWJMSCs和hPDLSCs, 胰酶消化、離心,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1.0×105/ml，分別均勻接種在預(yù)先處理置于24 孔板的2 種膜上，形成細(xì)胞材料復(fù)合體，將其在37 ℃ 、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d后將培養(yǎng)基換為成骨誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)，21 d后掃描電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合后細(xì)胞粘附率測(cè)定

hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx、PHBV接種后，2 種細(xì)胞在PHBV膜上的粘附率高于其他各組，其中hUCWJMSCs接種于PHBV膜的粘附率最高；而hPDLSCs與PHBHHx粘附率最低。從數(shù)據(jù)可以看出，隨著接種時(shí)間的增長(zhǎng)，粘附率成遞增趨勢(shì)，24 h時(shí)各組粘附率均最大(表 1)。

2.2 MTT法測(cè)定hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后細(xì)胞增殖能力

結(jié)果表明hUCWJMSCs在PHBHHx、PHBV膜上增殖明顯增快(P<0.05)，同時(shí)在PHBV膜上A值明顯高于PHBHHx(P<0.05)；hPDLSCs在PHBV膜上增殖明顯增快(P<0.05)，而在PHBHHx增殖不明顯(P>0.05)(圖 1)。

2.3 hUCWJMSCs、hPDLSCs與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后細(xì)胞成骨分化能力測(cè)定

2.3.1 ALP半定量檢測(cè) hUCWJMSCs和hPDLSCs分別與PHBHHx、PHBV支架結(jié)合后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，ALP檢測(cè)成骨誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV膜ALP的表達(dá)明顯高于與PHBHHx膜；hUCWJMSCs與兩種膜的ALP表達(dá)高于hPDLSCs(圖 2)。

2.3.2 茜素紅染色 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別于PHBHHx、PHBV支架結(jié)合成骨誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅染色。對(duì)照組染色均未見紅色顆粒形成；誘導(dǎo)組中hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV支架組可明顯的紅色被染鈣化基質(zhì)，hUCWJMSCs與PHBHHx支架可見到紅色被染基質(zhì)，hPDLSCs與PHBHHx支架被染紅色鈣化基質(zhì)較少(圖 3)。

表 1 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV的粘附率

圖 1 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別與接種于PHBHHx、PHBV后第3天的增殖情況

圖 2 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導(dǎo)后ALP活性

圖 3 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導(dǎo)后的礦化檢測(cè)(茜素紅染色, ×30)

2.3.3 hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合后掃描電鏡觀察 hUCWJMSCs和hPDLSCs分別于PHBHHx、 PHBV支架結(jié)合成骨誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行掃描電鏡。電鏡下PHBHHx、 PHBV膜表面較粗糙，其中PHBHHx為球狀突起，中間形成有孔結(jié)構(gòu)；PHBV膜含有大量的有孔結(jié)構(gòu)且彼此相通。成骨誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)組中hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV支架組可見明顯的細(xì)胞附著，在細(xì)胞周圍可見大量鈣結(jié)節(jié)和礦化基質(zhì)形成； hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBHHx支架細(xì)胞附著較少，形成的礦化基質(zhì)也較少(圖 4)。

圖 4 hUCWJMSCs、hPDLSCs分別接種于PHBHHx、PHBV成骨誘導(dǎo)后表面形態(tài)觀察(SEM, ×2 000)

3 討 論

牙周骨組織再生是臨床治療和研究的難點(diǎn)，快速發(fā)展的骨組織工程為牙周骨再生提出了新的思路[4-5]。大量的研究集中在種子細(xì)胞的選擇、支架材料的生物性能及相關(guān)的調(diào)控因素的研究[6-7]。關(guān)于hUCWJMSCs應(yīng)用于牙周組織修復(fù)等方面的研究也成為熱點(diǎn)[8]，其和hPDLSCs的成骨分化能力分別被諸多實(shí)驗(yàn)證明[9-10]，同時(shí)也分別比較與其他成體干細(xì)胞成骨分化能力[11-12]，但是關(guān)于hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種干細(xì)胞成骨分化能力的研究尚缺乏，與支架材料結(jié)合后的成骨能力方面的研究也較少。

種子細(xì)胞與支架結(jié)合后的良好的生物相容性及成骨分化能力是應(yīng)用于骨組織工程的前提。Wang等[13]將hPDLSCs與牙骨質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分別與靜電紡絲PHBV共聚體支架結(jié)合，結(jié)果顯示支架復(fù)合體表現(xiàn)出良好的細(xì)胞黏附率和增殖能力。研究表明hUCWJMSCs與PHBHHx和 PHBVHHx支架具有很好的生物相容性，能夠促進(jìn)hUCWJMSCs的生長(zhǎng)和支持hUCWJMSCs向成骨細(xì)胞的分化。在本課題組前期的研究中，體外比較了2 種干細(xì)胞的成骨分化能力，但未復(fù)合支架材料。PHBV、PHBHHx是PHAs家族中研究比較多的成員[14]，因其具有良好的生物相容性、可降解性以及無(wú)毒性目前廣泛應(yīng)用于組織工程技術(shù)中[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將hUCWJMSCs和hPDLSCs與支架材料PHBV、PHBHHx結(jié)合并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，探討哪種支架復(fù)合體更適合于牙周骨組織工程研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著接種時(shí)間的增加，細(xì)胞的粘附率增加，此結(jié)果提示在研究過(guò)程中細(xì)胞至少接種24 h后方可進(jìn)行其他方面研究。hUCWJMSCs和hPDLSCs在PHBV膜上A值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，及PHBHHx組(P<0.05)，表明hUCWJMSCs和hPDLSCs與PHBV膜有良好的生物相容性，這與其他研究得出類似的結(jié)論[17]。掃描電鏡觀察到PHBV相對(duì)于PHBHHx膜具有更大的孔隙率及連通情況，為細(xì)胞黏附提供了良好的空間，這也就解釋了2 種細(xì)胞與其生物相容性更好的原因。研究顯示在保證材料機(jī)械強(qiáng)度的情況下應(yīng)盡可能的增加孔隙率及連通率以利于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[7]。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為材料孔徑的大小應(yīng)該在220 μm左右以適應(yīng)人體自身骨單位同時(shí)保證相關(guān)成骨物質(zhì)ALP及骨鈣素等的表達(dá)，故成骨誘導(dǎo)后于PHBV支架可看到大量細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞支架復(fù)合體成骨誘導(dǎo)后ALP檢測(cè)、茜素紅結(jié)果說(shuō)明2 種干細(xì)胞與PHBV膜結(jié)合后在成骨誘導(dǎo)劑的作用下均可向成骨方向分化且優(yōu)于PHBHHx，同時(shí)hUCWJMSCs較hPDLSCs在PHBV膜上表現(xiàn)除更強(qiáng)的成骨能力。Cheng等[18]將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與PHBV膜結(jié)合植入備犬脛骨骨缺損模型，結(jié)果顯示PHBV膜無(wú)明顯毒性，術(shù)后12 周骨缺損基本被新骨填充，證明PHBV為一種較理想的引導(dǎo)骨組織再生的天然材料。hUCWJMSCs與PHBV支架復(fù)合物可作為牙周骨組織工程的種子細(xì)胞和支架材料進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上，hUCWJMSCs與PHBV支架的生物相容性和成骨分化能力較hPDLSCs更有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)2 種干細(xì)胞與PHBV較PHBHHx具有更好的生物相容性和成骨分化能力，說(shuō)明hUCWJMSCs與支架材料PHBV在牙周骨組織工程應(yīng)用方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)在后期的實(shí)驗(yàn)中，需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究此細(xì)胞支架復(fù)合體體內(nèi)成骨情況以及臨床應(yīng)用的免疫特性和安全性。